反相液相色谱法测定烟叶中精甲霜灵残留量

反相液相色谱法测定烟叶中精甲霜灵残留量

甲霜灵是世界上首次提出的具有立体旋光活性的杀菌剂。它是一种酰胺类杀菌剂。主要用于处理种子、土壤和茎叶。它对由卵菌病引起的黑胫骨病、粉菌病和其他作物的霜菌病和抗病性有很好的预防效果。由于精甲霜灵较高的杀菌活性和对烟草黑胫病良好的防治效果,该产品自2004年7月在烟草上取得临时登记以来,广泛用于预防和治疗由真菌引起的烟草黑胫病,但这也是导致精甲霜灵在烟草上残留、进一步带来安全危害的缘由。近年来,有关精甲霜灵残留的研究报告多集中在蔬菜水果、葡萄酒、茶叶等领域,国内外关于测定烟叶中精甲霜灵残留的方法报道较少。因此,需要建立1种简便、准确、易行的检测烟叶中精甲霜灵的方法。目前,烟草中甲霜灵的残留分析方法为“烟草及烟草制品拟除虫菊酯杀虫剂、有机磷杀虫剂、含氮农药残留量的测定”(GB/T13595-2004),该法采用丙酮提取,乙酸乙酯和环己烷进行液–液分配萃取,凝胶渗透色谱和硅胶柱层析净化,气相色谱法或气相色谱–质谱法测定包括甲霜灵在内的23种农药残留。但该方法前处理操作繁琐耗时、试剂用量大、成本高,不适用于甲霜灵单种农药的残留分析。关于精甲霜灵残留的测定方法,目前仅有李义强等、曹爱华等对鲜烟叶中精甲霜灵测定的报道。由于烘烤烟叶样品中干扰物质多,所含色素、生物碱、脂类和酚类等化学成分因浓缩存在量大的问题,给分离测定带来困难,且不同烟叶样品,其化学成分的含量也不同,因此,建立1种适用于烘烤烟叶中精甲霜灵残留测定的方法迫在眉睫。本法采用丙酮+正己烷作为混合提取剂,正己烷+乙酸乙酯混合淋洗液配合中性氧化铝层析柱净化,反相液相色谱检测,实现了杂质峰与目标峰的分离,且在前处理过程中,避免了乙腈、甲醇的使用,减少了对人体和环境有毒害试剂的用量。本文建立的方法不仅准确、实用,且具绿色环保的意义。1实验部分1.1高效蒸发仪器岛津LC–20AT液相色谱仪(配有紫外检测器和LC–Solution化学工作站);HY–B回旋振荡器;RE–52A旋转蒸发仪;电子天平(感量0.01g);玻璃层析柱(20cm×1.5cm)以及实验室常用玻璃仪器。精甲霜灵标准品(97.1%,国家标准物质研究中心提供);正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷(均为色谱纯);无水Na2SO4(分析纯);中性氧化铝(200~300目,化学纯)。1.2样品的制备和预处理1.2.1样品的制备烟叶剔去烟筋,剪切成2cm小块,40℃恒温干燥3h,四分法缩分后放入食品切碎机中搅碎过40目筛,置于棕色广口瓶中,保存供检测。1.2.2样品的预处理1.2.2.提取剂为23称取上述烟叶粉末5.00g(精确至0.01g)于250mL具塞锥形瓶中,加入50mL正己烷+丙酮(体积比为2∶3)提取剂,浸泡30min后,振荡提取30min,静置,滤出滤液,再用20mL提取剂振荡提取15min。合并2次提取液,量取50mL提取液转移至分液漏斗中,加入20mL2%硫酸钠水溶液,用50,40,30mL二氯甲烷萃取3次,合并有机相,过无水硫酸钠漏斗脱水,浓缩至近干,浓缩物用2mL正己烷溶解待净化。1.2.2.净化液的制备为去除烟草提取液中的色素、脂类、生物碱等杂质,避免对精甲霜灵的测定产生干扰,根据相似相溶原理,采用不同配比的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂淋洗层析柱。首先在20cm×1.5cm玻璃层析柱内依次填入2.0cm高的无水硫酸钠、5.0g中性氧化铝、2.0cm高的无水硫酸钠;再用10mL正己烷淋洗该层析柱。将浓缩后的提取液转移至该柱内,用20mL正己烷+乙酸乙酯(体积比为95∶5)混合洗脱剂淋洗,部分极性较弱的杂质首先被洗脱,弃去淋洗液;再以50mL正己烷+乙酸乙酯(体积比为50∶50)混合洗脱剂洗脱精甲霜灵,并收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪于40℃水浴中旋蒸至近干,冷却后用1mL甲醇定容,过0.45uf06dm尼龙滤膜,待测。1.3流动相、温度色谱柱:DIKMADiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5uf06dm);柱温:35℃;流动相:采用梯度洗脱,甲醇+水(体积比为53∶47)0~15min,甲醇+水(体积比为90∶10)15~25min,甲醇+水(体积比为53∶47)25~30min;流速:1.0mL/min;进样量:20uf06dL;检测波长:220nm。精甲霜灵标样溶液的色谱图见图1。1.4标准工作曲线准确称取97.1%的精甲霜灵标准品0.0120g(精确至0.0002g),用甲醇定容于50mL容量瓶中,配制成250mg/L的精甲霜灵母液,再用甲醇稀释成0.1,0.5,2.5,5.0,10.0,25.0mg/L的系列标样溶液,在上述色谱条件下分别进样,2次重复。以峰面积为纵坐标,标样溶液质量浓度为横坐标,作图。得到标准工作曲线:y=34169.05x–2632.57;相关系数:r=0.9999。2结果与讨论2.1叶片样品前处理条件的优化和选择2.1.1提取剂为正己烷+丙酮据报道,精甲霜灵残留的提取剂主要有甲醇、丙酮、乙腈、丙酮+甲醇(体积比为1∶1)等。在本实验中,从目标物的回收率和提取干扰物两方面综合考虑,考察了以乙腈、丙酮+甲醇(体积比为1∶1)、正己烷+丙酮(体积比为1∶1)、正己烷+丙酮(体积比为2∶3)为提取剂时烟叶样品中精甲霜灵的提取效果。实验表明,分别以乙腈和丙酮+甲醇(体积比为1∶1)作为提取剂时,由于提取剂的极性大,除了溶解目标组分外,还会提取大量基体物质,为后面的净化带来很大困难,造成目标组分与杂质色谱峰难以分离。而以正己烷+丙酮为提取体系时,由于丙酮具有较强的渗透能力,而正己烷可降低提取体系的极性,从而减少了基体成分的提取。实验考察了以正己烷+丙酮(体积比为1∶1)和正己烷+丙酮(体积比为2∶3)为提取剂的提取效果,结果表明,正己烷+丙酮(体积比为2∶3)提取效率大于80%,较正己烷+丙酮(体积比为1∶1)提取效率高,故选用正己烷+丙酮(体积比为2∶3)为提取剂。2.1.2柱层析法操作烟草成分复杂,净化是农药残留分析中的关键步骤。净化方法一般有柱层析法、液–液分配法和凝结法。其中,柱层析法的操作较简单。对于精甲霜灵来说,常用的吸附剂主要有硅胶、Florisil硅土和氧化铝。实验对比了硅胶、Florisil硅土和中性氧化铝3种正相吸附剂的净化效果。结果表明,硅胶洗脱速度较慢,费时;与Florisil硅土相比,中性氧化铝价格便宜、淋洗液用量较少,故本方法选择中性氧化铝作为吸附剂。2.1.3洗脱溶剂浓度对精甲霜灵回收率的影响选用合适的洗脱剂,既可满足回收率的要求,又能减少杂质峰对目标峰的干扰。实验比较了不同体积比的正己烷+乙酸乙酯(体积比为95∶5,70∶30,50∶50,30∶70)的洗脱效果,结果发现,以正己烷+乙酸乙酯(体积比为95∶5)洗脱时,精甲霜灵回收率几乎为零,可能是由于洗脱剂极性太小;当以正己烷+乙酸乙酯(体积比为70∶30)洗脱时,回收率低于60%;以正己烷+乙酸乙酯(体积比为50∶50)洗脱时,回收率在77%~85%之间;以正己烷+乙酸乙酯(体积比为30∶70)洗脱时,回收率有所下降,这是由于洗脱剂极性增加,洗脱出的杂质增多,杂质峰干扰目标峰。最终,柱层析选择以正己烷+乙酸乙酯(体积比为95∶5)洗脱部分杂质,再以正己烷+乙酸乙酯(体积比为50∶50)为洗脱剂,淋洗提取液。2.2方法的回收率和相对标准偏差准确称取5.00g烟叶样品(因缺乏空白样品,先分析计算样品中所含精甲霜灵含量,然后在进行加标回收率计算时扣除),样品加标回收率的测定设定3个加标水平,分别为0.2,1.0,2.0mg/kg,最高加标水平参照国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)农用化学品委员会(ACAC)指导性残留量,每个加标水平平行测定3次。以信噪比(S/N)≥3时对应的质量分数确定为方法的最低检测浓度(LOQ)。按照1.2和1.3所述操作步骤处理后,计算各加标水平下的平均回收率和相对标准偏差,结果见表1。精甲霜灵在3种加标水平下的平均回收率为77.1%~82.3%,相对标准偏差在4.3%~5.1%之间,方法的最低检测浓度为0.04mg/kg。无精甲霜灵残留的样品色谱图及加标水平为2.0mg/kg的样品色谱