不同氮源对两株热带淡水微藻生长的影响

不同氮源对两株热带淡水微藻生长的影响

微藻是水体、湿地、海滩和其他环境中的一种常见藻类。年处理能力强的二氧化碳占世界二氧化碳固定量的40%以上。它是能量转化和碳元素循环的重要支撑。微藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量高等特点,是生产生物质能的潜在资源,因此成为目前国内外的研究热点。微藻生物柴油是公认的理想可持续发展能源,但偏高的成本成为限制微藻生物柴油产业化的主要瓶颈,因此通过高脂微藻的筛选、培养条件的优化来提升单位体积微藻油脂的产量来降低成本是十分必要的。通过改变培养基化学成分的方法来控制微藻的新陈代谢,可以提高微藻单位体积油脂产量。氮是微藻生长所必需的基本元素之一,是构成藻体内蛋白质、核酸及色素的重要元素,对于藻类的生长发育有着重要的作用。微藻可以利用的氮源范围较宽,如无机氮源(氨态氮、硝态氮)、有机氮源(尿素、酵母膏、氨基酸等)。氮源类型对微藻的生长及油脂积累有着较为显著的影响,且不同的藻种对氮源的适应性有差异。本文以新分离的2株藻——网状空星藻Coelastrumreticulatum及栅藻Scenedesumssp.为对象,研究不同氮源对它们的生长及总脂含量的影响,以期为开拓富油微藻种质和加强油脂积累提供实验依据。1材料和方法1.1淡水水体处理试验藻种网状空星藻C.reticulatum及栅藻S.sp.分别分离自海口五公祠和金牛岭公园的淡水水体,由海南大学材料与化工学院生物工程实验室保藏。试验用药品均为国产分析纯(广试)。1.2生物反应器培养藻种均利用实验室自行设计的直径8.0cm柱状光生物反应器进行一次性培养。培养期间温度控制在(26±2)℃,单侧日光灯提供24h连续光照,光照强度150μmol·m_2s·_1,持续通入无菌空气。1.3硝铵混合氮nh4no3以淡水BG11培养基为基础,选取4种氮源,分别为硝氮(NaNO3)、氨氮(NH4Cl)、有机氮(尿素)以及硝铵混合氮(NH4NO3),N浓度为17.6mmol·L_1。试验前对藻种进行驯化培养,以使之适应不同氮源环境。初始接种OD680约为0.05,培养时间约2周。1.4测量1.4.1防水笔ph测定在试验周期内,每天测定培养液的OD680、pH以及色素含量。OD680以TU-1810紫外可见分光光度计测定;pH以pHscan30型防水笔型pH计测定;色素测定:取一定量的藻液,离心弃去上清,加入等体积甲醇50℃超声提取20min,离心测定上清液的OD665、OD652和OD480,色素含量由下式计算:培养完成后,取10mL藻液经已烘干称量的0.45μm滤膜抽滤,置于80℃烘箱烘至恒质量,测定最终干质量,重复3次。1.4.2超声-超声法参照许瑾等的方法进行总脂含量测定(略有改进):培养结束时离心收获藻体后冻干、研磨,准确称取0.2g左右藻粉,置于具塞玻璃离心管中,加入2~4mL二甲基亚砜甲醇(10%,V/V)溶液,50℃水浴超声15min后,转入冰水浴中继续超声30min。离心收集上清液,余下藻泥加入乙醚正己烷混合溶剂(1∶1,V/V)并使用磁力搅拌器4℃下搅拌至藻泥灰白,合并上清液,加入蒸馏水调节上清体积比例为甲醇:乙醚:正己烷:水=1∶1∶1∶1后静置过夜,取上层置于已称重的离心管中,氮气吹干后置于50℃烘箱烘至恒质量后称质量。重复3次。1.5数据分析数据分析采用SAS软件单因素方差分析(ANOVA)中的duncan多重比较法,绘图采用Excel和Origin软件。2结果2.1种藻生长情况比较不同氮源条件下2种微藻生长的生长曲线见图1,由图可知,2株藻均在添加硝态氮(NaNO3)的情况下生长状况最佳,而在添加铵态氮(NH4Cl)条件下生长状况最差;添加铵硝混合氮(NH4NO3)条件下,2种藻生长速度也都快于铵态氮(NH4Cl)。2株微藻收获时干质量如表1所示,2株藻分别在添加NaNO3和NH4Cl的情况下获得了最高干质量(分别为(0.72±0.08)g·L_1和(0.80±0.03)g·L_1)和最低干质量(分别为(0.62±0.04)g·L_1和(0.50±0.02)g·L_1)。2.2微藻ph的变化不同氮源存在下2株藻培养液的pH变化见图2,可知在培养期间2株微藻的NaNO3、尿素组pH波动均较小,而两株微藻的NH4Cl组pH则自接种时开始迅速下降,最低pH3.09出现于S.sp.的NH4NO3组第11天。根据生长状况及pH变化,可以推测C.reticulatum和S.sp.的最佳生长pH可能分别在8.5~10和8.5~9.5。2.3ssp.尿素对不同氮源对于C.reticulatum色素的积累并无明显影响,各组在5d均开始进入平稳期,而NH4Cl组的叶绿素a自7d开始出现明显下降,一直持续到培养结束(图3)。Ssp.尿素组和NaNO3组色素增幅较快。其中尿素组叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的最高含量出现在第7天左右,分别为6.235、3.267、3.338μg·mL_1,NaNO3组叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的最高含量亦出现在第7天左右,分别为5.663、2.704、3.157μg·mL_1,而此时它们均已进入平稳期(图1b),8d后各色素开始出现下降趋势,其中尿素组下降速度较快(图4)。2.4氮源对微藻总脂产量的影响C.reticulatum及S.sp.均以NH4Cl组总脂含量最高(图5),分别为(38.35±1.32)%和(30.24±3.13)%。二者NaNO3组和NH4NO3组间总脂含量差异均不明显(p>0.05),其他各组之间差异均显著(p<0.01)。结合2株微藻的NH4Cl组生长情况均不佳,推测该藻可能是因为不能很好地利用铵态氮,因而在铵态氮存在的条件下造成了“缺氮”假象,造成油脂大量积累,最终造成NH4Cl组总脂含量较高。此外,NH4NO3组硝态氮的浓度为NaNO3组的一半,并且前者pH也较后者不稳定,但二者总脂含量差异不明显,说明pH的变动与硝态氮减半对2株微藻油脂合成并无明显影响。2种藻不同氮源条件下单位体积总脂产量见表2,C.reticulatum和S.sp.的单位体积总脂产量均以NaNO3组最佳,分别高达199.26mg·L_1和190.76mg·L_1,可见二者非常适宜作为微藻生物柴油的开发对象。另外笔者还发现,在不添加氮源的情况下,C.reticulatum的总脂产量可高达386.03mg·L_1,远远高于NaNO3组。3讨论3.1铵态氮对微藻生长和复育的影响目前关于氮源对微藻生长影响的相关研究较多,但结论不尽相同,如Li等研究硝态氮(NaNO3)、有机氮(尿素)与铵态氮((NH4)2CO3)对富油新绿藻Neochlorisoleoabundans的影响,结果表明添加铵态氮的藻液生长状况最差,这与本研究中的结果相同;张青田等的研究结果表明纤细角毛藻Chaetocerosgracilis、赤潮异弯藻HeterosigmaakashiwoHada)、亚历山大藻Alexandriumsp.等3种藻在铵态氮(NH4Cl)存在的情况下生长状况好于有机氮(尿素),而隐藻Chroomonassalinaf.adolenscens则相反。氮是诸多物质,如叶绿素、Rubisco等光合酶、构成同化力的ATP和NADPH等的组成成分,因此对光合作用的影响很大。自然界中除少数蓝藻具有自身固氮能力外,其他微藻必须从环境中吸收一定的氮源以满足其生长的需要,且不同的藻种对氮的种类和浓度需求不同。一般认为微藻最容易利用铵态氮,但是随着NH4+被利用,培养液的pH逐渐下降,以至于抑制微藻的生长,因而高浓度的铵盐反而会抑制微藻的生长。但是在本研究中,2种藻在铵态氮存在的情况下生长情况一直不佳,说明本实验所涉及的2种藻更加偏好于硝态氮,其原因可能是2株藻均分离自流动性较好的淡水水体中,导致水体中富含可将氮元素(死亡动、植物分解所产生的蛋白质、氨基酸等)分解为亚硝酸盐并最终氧化为硝酸盐的好氧细菌,使其富含硝酸盐,藻类长期生存于该环境,逐渐适应并演化出利用硝态氮的机制。本研究中铵态氮呈现对2种微藻生长的抑制作用也可能源于pH的变化,据报道,pH对微藻细胞生长的影响主要是通过引起细胞膜电荷变化和改变营养物质的离子化程度来影响细胞对营养物的吸收,或者是影响细胞内多种酶的活性。由于本研究中一律采用一次培养法,期间未对培养基pH进行控制,加之随着微藻对氮源的吸收利用,因此会造成培养液的pH下降,这可能会影响铵态氮的离子化,使其无法通过离子通道而为微藻细胞所利用;另外,pH过低还可能影响相关代谢过程中的酶,从而抑制微藻的生长。3.2微藻生物柴油的生产氮源对于油脂积累及其成分的影响较大,目前一般认为,氮缺乏条件下能够引起微藻油脂大量积累,但会影响其生长;而氮充足条件下则利于微藻细胞的生长、分裂,但不利于油脂的积累。由于单位体积油脂产量是衡量微藻生物柴油经济性的指标,它同微藻的生物量及油脂含量均相关,因此最大化单位体积油脂产量是提升微藻生物柴油可行性的基本条件。Suneerat对分离自泰国某淡水水域的藻种BotryococcusbrauniiKMITL2进行油脂生产优化,发现初始氮浓度对于生物量的影响不大,但各组的总脂含量具明显差异,且在氮浓度较低(86mg·L_1)情况下获得了最高的油脂产量。Li等的研究结果表明,NaNO3对于N.abundans的油脂积累效果最佳,这与本实验中的结论相同。因此不同微藻的最利于油脂积累的氮源类型有所不同,本文所涉及的2株藻最高油脂含量虽均为NH4Cl组,但单位体积总脂产量以NaNO3组最高,因此二者的最适氮源均为硝态氮。4光合效率与硝态氮增长速率的关系(1)网状空星藻C.reticulatum及栅藻S.sp.在NaNO3存在的条件下生长状况最佳,最终生物量分别为(0.72±0.08)g·L_1和(0.80±0.03)g·L_1,与光合作用有关