转基因动物和克隆动物课件

转基因动物和克隆动物转基因动物和克隆动物1转基因动物1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。转基因动物1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生2转基因动物技术概念研制的方法技术的优点发展前景克隆动物转基因动物技术概念3含外源基因的载体基因微注射移植受精卵小鼠出生转基因鼠的检测繁殖后代含外源基因的载体基因微注射移植受精卵小鼠出生转基因鼠的检测繁4转基因动物和克隆动物

一、转基因动物概述（一）转基因动物概念转基因动物是指通过基因工程对DNA进行体外操作，添加或删除一个特殊的DNA序列，然后导入早期的胚胎干细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。这些改变包括：（1）外源DNA片段至少整合到一条染色体上；（2）由于外源DNA的插入使任何一个基因发生改变；（3）由于外源DNA的插入或内源基因的删除使染色体发生重排；（4）有意识地导入可以持久存在的遗传实体。转基因动物和克隆动物一、转基因动物概述5（二）转基因动物的命名

1．符号(1)一个转基因符号由以下三部分组成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段标示；＃＃＃＃＃=实验室指定序号；Zzz=实验室注册代号；（二）转基因动物的命名

1．符号6(2)方式转基因符号通常冠以Tg字头。随后的一个字母（X）表示DNA插入的方式：H代表同源重组；R代表经过逆转录病毒载体感染的插入；N代表非同源插入。(2)方式7（3）插入片段标示An匿名序列；Ge基因组；Im插入突变；Nc非编码序列；Rp报告基因；Sn合成序列；Et增强子捕获装置；Pt启动子捕获装置。（3）插入片段标示82.举例C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：

来源于美国杰克逊研究所（J）的C57BL/6品系小鼠被转入人的CD8基因组（Ge）；转基因在JonW.Gordon(Jwg)实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为23的小鼠。2.举例9二、转基因动物的基本原理和方法（一）基本原理将改建后的目的基因用显微注射等方法注入实验动物的受精卵，然后将此受精卵再植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过转入外源基因培育优良品种的工程动物等。二、转基因动物的基本原理和方法（一）基本原理101.外源目的基因的分离2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组3.重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞4.胚胎移植技术5.鉴定及筛选6.目的基因整合率及表达效率的检测（二）转基因动物的关键技术（二）转基因动物的关键技术111.采取受精卵采取受精卵的方法分为获得自然排卵的受精卵的方法和以激素诱发排卵的方法，还有采取未受精卵，然后在体外受精的方法。2.向受精卵雄性原核注入DNA溶液通过微分干涉显微镜观察受精卵，会看到两个大的原核。两个核不久即可融合，接着核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容纳更多的DNA溶液，一般是向雄性原核注入DNA溶液。3.向假妊雌小鼠移植（1）假妊雌小鼠的制作（2）将操作卵移植至输卵管4.转基因动物的检测Ⅰ显微注射法1.采取受精卵Ⅰ显微注射法12Ⅱ逆转录病毒法

原理：逆转录病毒的核酸为一条单链RNA分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建成重组载DNA。另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。如果重组病毒DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA引入宿主细胞。Ⅱ逆转录病毒法原理：13Ⅱ逆转录病毒法步骤：1.逆转录病毒载体的构建2.选择和培养包装细胞系3.重组病毒DNA导入包装细胞4.收集重组病毒颗粒5.感染胚细胞，使细胞转化此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。Ⅱ逆转录病毒法步骤：14Ⅲ胚胎干细胞法胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

Ⅲ胚胎干细胞法胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎15利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1.3.5天的孕鼠2.分离胚细胞3.转入培养皿中培养4.分离内层细胞团5.收集干细胞克隆6.酶处理解散细胞7.培养干细胞8.转染干细胞9.植入代孕母鼠体内利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1.3.5天的孕鼠16在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术

2007年诺贝尔生理学或医学奖分别授予两名美国人马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯和一名英国人马丁·埃文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方面的突出贡献。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，三位科学家“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物ＤＮＡ重组方面有着一系列突破性发现”，为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可以使小鼠体内的特定基因丧失功能。此类“基因敲除”试验可以帮助人们了解基因在胚胎发育等多种现象中发挥何种作用。“基因靶向”技术为阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用。在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术2007年诺17在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术基因打靶是指通18Ⅳ精子载体法精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。Ⅳ精子载体法精子载体法是精子和外源DNA混合19Ⅴ体细胞核移植法1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。1997年6月Wilmut报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆绵羊“波莉”。1999年，美国科学家Alexander克隆了３头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。Ⅴ体细胞核移植法1997年，英国科学家Schn20Ⅵ受体介导法是将外源DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA进入受体细胞，从而实现基因转移。1999年，Ivanava用受体介导法制作了转基因鼠。Ⅵ受体介导法是将外源DNA与受体分子连接后与胚21提高转基因效率的策略1、对外源基因的整合机制进行深入研究，避免基因的随机整合，提高基因的表达效率。2、建立更完善的转基因方法。利用胚胎干细胞介导可以进行基因表达的体外选择，是提高转基因效率的有效方法。3.探索有效的阳性胚胎筛选方法。4.使用大的外源DNA片段。5.选择表达效率高的启动子。6.其它DNA顺序的影响。如顺式调控区元件等。提高转基因效率的策略1、对外源基因的整合机制进行深入研究，避22三、转基因动物的应用（一）提高动物优良性状、改善动物产品质量（二）动物抗病育种（三）生产药用蛋白（四）生产人用营养保健品（五）生产可用于人体器官移植的动物器官（六）建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型三、转基因动物的应用23四、克隆动物

动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。四、克隆动物

动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术24五、克隆动物的基本方法

（一）细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。（二）细胞核移植方法先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。然后，将带转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的仔畜百分之百是转基因动物。五、克隆动物的基本方法

（一）细胞核移植技术，是指将一个动物25（三）细胞核和克隆的分类按使用的细胞性质不同克隆可分为：①胚性克隆用未分化的胚胎进行胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胚胎成纤维细胞核移植、胚胎分割或胚胎嵌合等操作培育出新个体；②无性克隆用已分化的体细胞进行核移植培育出新个体，亦称体细胞克隆。当前谈论的克隆多指体细胞克隆。根据供核体细胞的不同，动物克隆又可分为两种类型：①同种体细胞克隆用相同物种体细胞进行核移植；②异种体细胞克隆将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。按研究目的不同，克隆可分为生殖性克隆与治疗性克隆；生殖性克隆指无性繁殖新个体，治疗性克隆指用克隆技术培育出某些组织器官用于医疗。（三）细胞核和克隆的分类26六、克隆动物的应用克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。六、克隆动物的应用27技术优点1.转基因动物可以提高生产能力。（瘦肉型猪）2.转基因能增强抗病能力。（转基因鲑鱼）3.转基因能生产生物医学产品。（转基因猪生产人血红蛋白）技术