分子标记辅助选择育种省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件

第十四章分子标识辅助选择育种作物育种：创造变异，选择优良变异传统育种选择方法：依据植株表现型选择缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环境条件影响大（如抗病、抗虫等）经过与目标性状基因连锁、易于识别性状作为标识，对目标性状进行间接选择（相关选择）第一节分子标识辅助选择意义第1页遗传标识：可遗传、特殊、易于识别表现形式遗传标识类型：形态标识、细胞学标识、生化标识、分子标识分子标识：直接反应基因组间DNA差异遗传标识分子标识辅助选择：经过与目标性状基因紧密连锁分子标识来判断控制目标性状基因是否存在优点：不需要考虑作物生长条件和环境条件；降低基因互作干扰；快速垒集目标基因，加紧育种进程；降低群体种植规模等第2页简称RFLP标识第二节分子标识类型及原理一、分子标识类型1、以DNA-DNA杂交为基础DNA标识技术（insituhybridization）限制性片段长度多态性标识（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可变数目串联重复序列标识（Variablenumberoftandemrepeats）简称VNTR标识原位杂交简称ISH第3页2、基于PCRDNA标识1）单引物PCR标识2）双引物选择性扩增PCR标识3）经过克隆、测序来构建特殊双引物PCR标识。

第4页限制性酶切片段选择性扩增3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合DNA标识分为两类PCR扩增片段限制性酶切如AFLP如CAPs第5页Singlenucleotidepolymorphism，4、基于单核苷多态性DNA标识单核苷酸多态性简称SNP第6页用限制性内切酶酶切不一样个体基因组DNA后，含有与探针序列同源酶切片段在长度上差异。二、主要分子标识1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段长度多态性1980，Bostein第7页碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes）酶切位点增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段改变基因组DNA序列上改变（1）RFLP标识原理第8页（2）RFLP标识分析步骤第9页

（3）RFLP标识特点优点①数目几乎无限②共显性③能够利用现有探针，含有种族特异性④RFLP标识遍布全基因组⑥重复性好第10页缺点成本较高;需要许多克隆探针；一个探针只能产生一个多态位点；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染第11页随机排列寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。经过PCR扩增染色体组DNA所取得长度不一样多态性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）随机扩增多态性DNA1990,Williams第12页特异性取决于引物与模板DNA结合特异性。PCR，聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。第13页RAPD与经典PCR反应区分①引物②反应条件③扩增产物第14页（2）RAPD标识特点优点1）可检测未知序列基因组DNA2）引物无种族特异性3）RAPD技术简单第15页4）单个引物可产生几个多态位点第16页5）经过克隆测序可转化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标识第17页缺点1）再现性差2）显性遗传3）存在共迁移问题第18页3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）扩增片段长度多态性1993，Zabeaumarc和Vospieter是对限制性酶切片段选择性扩增第19页（1）AFLP标识原理基因组DNA进行双酶切人工接头连接PCR反应引物凝胶电泳第20页AFLP扩增数量由酶切频率较低限制酶在基因组中酶切位点数量决定。限制性酶酶切频率较高限制性酶（frequentcutter），酶切频率较低限制性酶（rarecutter）产生易于扩增基因组DNA限制扩增模板DNA片段数量第21页3）选择扩增AFLP分析基本步骤1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA2）DNA片段两端连接上特定接头(oligonucleotideadapters)第22页6）自显影4）聚丙烯酰胺凝胶电泳5）凝胶转移，干胶处理荧光标识、银染第23页（2）AFLP标识特点优点

1）数目和种类很多

2）一次PCR反应可检测多个遗传位点3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假阳性低，可靠性高6）AFLP标识多数为显性第24页缺点分析成本高DNA纯度及内切酶质量要求也比较高甲基化敏感酶易产生假假阳性第25页(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因组内有一个短重复次数不一样关键序列可变数目串联重复序列简称VNTR小卫星（minisatellites）微卫星（microsatellites）第26页简单重复序列，又称微卫星DNA一类由1—6个碱基组成基序（motif）串联重复而成DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重复次数，其大小在10～60之间第27页微卫星DNA两端序列是相对保守单拷贝序列（1）SSR标识原理依据微卫星DNA两端单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点微卫星DNA序列，经过电泳分析关键序列长度多态性。第28页2）检测一个单一多等位基因位点。（2）SSR标识特点1）数量几乎无限，检测出多态性频率极高3）多数为共显性标识第29页使用SSR技术前提是需要知道重复序列两翼DNA序列。4）重复性高，稳定可靠5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻第30页引物设计采取2－4个核苷酸序列为基序（motifs），以其不一样重复次数再加上几个非重复锚定碱基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR标识相邻SSR区域内引物去扩增中间单拷贝序列第31页共显性遗传5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标识普通步骤RAPD分析克隆片段两端测序设计长为18～24bp引物PCR扩增检测高重复性优点第32页6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割扩增多态序列标签位点技术又称PCR-RFLP基本步骤特定引物PCR扩增PCR扩增产物限制性内切酶酶切酶切产物凝胶电泳检测第33页CAPs标识优点①引物与限制酶组合非常多②

CAPS标识呈共显性③所需DNA量极少④结果稳定可靠⑤操作简便、快捷第34页指基因组中长度为200—500bp，且核苷酸次序已知单拷贝序列，可采取PCR技术将其专一扩增出来。7、STS（Sequence-taggedSites）序列标签位点简称序标位YAC或cosmid插入末端序列引物起源RFLP单拷贝探针序列微卫星序列表示基因序列第35页很轻易在不一样组合遗传图谱间进行标识转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱中介。

8、表示序列标签（Expressedsequencetags，ESTs）表示基因部分序列共显性遗传突出优点第36页扩增基因开发阅读框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18个碱基，包含13-14个碱基关键区域（5’10-11个碱基为填充区，随即正向为CCGG，反向为AATT），关键区域后为3个选择碱基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相关序列扩增多态性第37页第38页SRAP特点优点1）每一反应可得大量多态位点2）不需克隆任何序列，引物可用于不一样生物；3）便利、简单；4）重复性好；5）PCR产物可直接测序。第39页基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。普通经过对PCR产物、基因组文库、表示序列标签（EST）文库测序而取得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）单核苷酸多态性等位基因遗传密码单碱基差异。特点：数量大第40页AChromosomeMapofTomato第三节主要农艺性状基因连锁标识筛选一、遗传图谱构建第41页1、作图群体建立（1）亲本选配亲本选择标准亲本间DNA多态性丰富；亲本纯度高；杂交后代可育。第42页（2）群体类型×F1P1P2F2F2群体第43页BC1群体第44页RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生一个作图群体，通常从F2代开始，采取单粒方法建立。常自交6-7代。重组近交系群体（recombinantinbredlines，RIL

）第45页DH群体单倍体经过染色体加倍形成二倍体第46页一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异株系近等基因系群体（Near-isogeneiclinesNIL）第47页拟测交（Pseudo-testcross）群体复合杂交群体（CP群体）第48页（3）群体大小构建分子标识骨架连锁图可用小群体150单株或家系。第49页连锁图谱构建理论是染色体交换和重组。AABB×abababABABabABba重组率可用来表示遗传图距，重组型配子最大百分比为50%，改变0-50%。图距单位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM大小大致符合1%重组率。2、图谱构建理论基础第50页两位点存在连锁(r＜0.5)概率与不连锁概率(r=0.5)比

为确定两位点之间存在连锁，普通要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定连锁存在，则要求似然比小于100，即LOD＜2。图谱制作统计学原理①两点测验L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比统计量来表示似然函数L()②多点测验第51页检测作图群体个体（株系）分子标识基因型P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112••••••3、标识基因型检测第52页4、图谱构建软件利用DNA标识数据，经过作图软件构建连锁图谱。MAPMKER/EXE3.0MapmangerQTX20Joinmap第53页陆地棉（渝棉1号×T586）F2:7群体第54页1、质量性状基因定位二、基因定位第55页（1）近等基因系分析第56页（2）分离群体分组混合分析

第57页

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12135

131480

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CMS育性恢复基因分子标识第58页控制数量性状基因2、数量性状基因定位数量性状基因座（quantitativetraitloci,QTL）第59页检验同一标识不一样基因型间数量性状均值差异（1）QTL定位方法1）基于标识分析方法均值差检测法若差异显著，则表明标识与QTL连锁。第60页陆地棉（渝棉1号×T586）F2:7群体QTL定位第61页2）基于性状分析方法分离群体分群分析法第62页选择性基因型分析法第63页

3、QTL定位软件Mapmaker/QTL1.0MapManagerQTXQTLCartographerMapQTLWindowsCartographer第64页4、QTL精细定位1）单个QTL精细定位连续用渝棉1号回交分子标识辅助选择渝棉1号T586T586渝棉1号群体大于1000第65页可靠性取决于标识与目标基因连锁程度。若只用一个标识对目标基因进行选择，则标识与目标基因间连锁必须非常紧密，才能够到达较高正确率。第四节分子标识辅助选择（MAS）育种一、分子标识辅助选择遗传基础1、前景选择对目标基因选择称为前景选择(foregroundselection)Hospital&Charcosset(1997)提出第66页供体受体RRRrrr(1-r)22r(1-r)r2MRmrMRmr目标基因与DNA标识间遗传距离位p亲本中DNA标识带型F1杂种中DNA标识带型在F2分离群体中分子标识类型即MM,Mm,mmMM类型分子标识所代表目标基因型及其频率利用MAS遗传基础（以RFLP为例）M—抗性标识R—抗性基因m—感病标识r—感病基因第67页

选择正确率随重组率增加而快速下降。重组值越小，其错选率越低。假如要求最少选到一株目标基因型概率为P，则必须选择含有标识基因型MM植株最少为：n＝log（1-P）/log（1-p）式中p＝（1－r）2第68页第69页对基因组中其它部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（backgroundselections）。背景选择对象几乎包含了整个基因组，所以，这里牵涉到一个全基因组选择问题，在分离群体中，因为在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，所以每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装杂合体。2、背景选择第70页第71页二、分子标识辅助选择优越性1.克服性状表现型判定困难2.允许早期选择3.控制单一性状多个（等位）基因利用4.允许同时选择多个性状5.可进行性状非破坏性评价和选择6.从育种进程考虑，可加紧育种进程，提升育种效率第72页三.分子标识辅助选择应具备主要条件

A：与目标基因紧密连锁分子标识B:简便快捷标识检测方法第73页Howtouseageneticmarkerformarker-assistedselectionWeaverCarrierSire+WW+++M1M2M1M2M3M3W=Weaver+=Normal第74页目标基因标识筛选（genetagging）是进行分子标识辅助选择（MAS）育种基础。用于MAS育种分子标识须具备三个条件：分子标识与目标基因紧密连锁标识实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。不一样遗传背景选择有效。第75页作物MAS育种须具备条件

分子标识与目标基因共分离或紧密连锁，普通要求二者间遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。含有在大群体中利用分子标识进行筛选有效伎俩，主要是应用PCR技术。筛选技术在不一样试验室间重复性好，且含有经济、易操作特点。含有实用化程度高并能帮助育种家作出抉择计算机数据处理软件。第76页四、MAS育种方法（一）回交育种（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育种第77页受体亲本×供体亲本(不含优质基因)(含优质基因)F1×受体亲本BC1目标基因定位标识辅助选择中选BC1×受体亲本(含优质基因)BC2BC3标识辅助选择标识辅助选择中选BC3(含优质基因)新育成优质品种(受体亲本遗传本背景+优质基因)自交目标基因定位与标识辅助回交育种相结合程序图中选BC1×受体亲本(含优质基因)第78页

受体亲本×供体亲本A(无优质基因)(含优质基因A)

受体亲本×供体亲本B(无优质基因)(含优质基因B)F1(含优质基因A)×F1(含优质基因B)复杂杂种(分离群体)

受体亲本×供体亲本C(无优质基因)(含优质基因C)

中选杂种个体×F1(含优质基因A和B)(含优质基因C)复杂杂种(分离群体)

中选杂种个体×受体亲本(含优质基因A、B和C)

新育成优质品种(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C)回交1~2代，标识辅助选择自交标识辅助选择标识辅助选择标记辅助基因聚合与品质改良相结合程序图第79页五、提升分子标识筛选效率（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子标识进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低MAS育种成本第80页

MAS育种研究范围：1.分子标识与资源评价（度量遗传多样性）2.分子标识与亲本选配3.MAS增强作物抗病性（转移新抗性基因，抗性基因累加或聚合）4.MAS提升作物杂种产量

第81页

品质性状分子标识体系HMW—GS：2*、7