生物化学技术6-凝胶过滤11市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件

第六章凝胶过滤1/70

凝胶过滤是20C-60Y发展起来一个分离纯化方法；又称分子筛层析、排阻层析

原理：凝胶含有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不一样进行筛分

特点：设备简单，操作方便、重复性好、回收率高

用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，测定蛋白质分子质量、样品浓缩和脱盐等

2/70目掌握凝胶分类和性质掌握凝胶过滤基本原理熟悉凝胶过滤操作与应用3/70第一节凝胶分类及性质

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凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和很好分子筛作用化合物当前主要有葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖；其次，还有聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合凝胶等5/706/707/70

商品名称：Sephadex，由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1，2环氧丙烷(交联剂)以醚键交联而成在交联葡聚糖G-25、G-50中加入羟丙基后，即可组成烷基化（LH型）葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶8/709/70①性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状皱纹②溶解性：带有大量羟基，亲水性好，所以在水溶液或电解质溶液中极易膨胀③型号：SephadexG-n（n越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔直径则越大④应用：1.理化性质凝胶过滤层析：以G型Sephadex为固定相，水为流动相，对水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：以LH型Sephadex为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离10/70

在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定、不溶解

强酸或氧化剂溶液时，则轻易使糖苷键水解断裂在室温下长久保留时，应加入适量防腐剂如CHCl3、0.05％NaN3或20％EtOH等

2.稳定性11/70

含少许羧基基团，为弱酸性物质。能与带正电荷分离物如碱性蛋白质等发生吸附

克服方法：提升洗脱液离子强度至0.05以上，可克服此非特异性吸附

①惯用含有NaCl缓冲液作洗脱液。

②新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆吸附性能，即使吸附数量较少，但在定量测定或者分离纯化极难得到物质时，也需先用易得到蛋白质进行预层析，方便消除其影响3.吸附性12/70

葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及一些凝集素含有较强吸附作用，若采取凝胶过滤层析分离它们时，往往利用是吸附性能，而不是排阻原理

13/7014/70

琼脂糖是从琼脂中分离出来一个由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成多糖。其商品名因生产厂家不一样而异瑞典、中国：Sepharose美国：Bio-gelA15m，排阻分子量小于15million分子，即15×106（排阻程度）

英国：Segavac，粉状、颗粒状丹麦：Gelarose

除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售

二、琼脂糖凝胶15/701.性质①高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶②对尿素、盐酸胍等含有较强抵抗力，在pH4.0~9.0缓冲液中稳定③层析流速较高④干胶易脱水破裂，普通存放于含防腐剂水溶液中，防止猛烈搅拌16/70①Sepharose2B(2％)、4B(4％)和6B(6％)Sepharose6B机械强度大于2B，不过筛孔小于2B②Sepharose与1，3-二溴异丙醇(1,3-dibromopropanol)在强碱性条件下反应后，即生成CL型交联琼脂糖(SepharoseCL）

这种琼脂糖筛孔与同浓度、未交联琼脂糖相同，但耐热、耐酸碱。不过在氧化剂存在下，会有少许多糖链发生解聚（稳定性提升）

2.应用形式（按浓度分）17/703.特点机械强度和筛孔稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层析时流速较快18/70

商品名称：Bio-gel（生物胶）。以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵作催化剂，在N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)加速剂作用下（化学催化），将丙烯酰胺(单体)聚合而成当改变单体浓度时，就可得到吸水率不一样产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯数字表示排阻程度

如Bio-gelP-150排阻程度为小于150×103Da三、聚丙烯酰胺凝胶19/70

聚丙烯酰胺凝胶普通制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。能忍受浓盐、尿素和胍盐等溶液浸泡；耐酸碱，但要防止长久与强酸和强碱接触，假如与其接触并在高温条件下，酰胺基将快速发生分解聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性和碱性化合物稍有吸附现象克服吸附方法：提升洗脱液离子强度

20/70

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成。此凝胶属硬性凝胶，它含有一定大小筛孔和少许羧基基团耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或尿素溶液作洗脱剂多用于蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖分离纯化，也用于病毒颗粒分离四、Sephacryl21/70

由高交联度琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特点：含有良好分子筛特征和理化稳定性。溶液酸碱度可在pH3~12范围内改变；溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍)时，也不会影响分离效果

五、Superdex22/70Superose：高交联度多孔琼脂糖珠玻璃珠：有大量网孔，且分布均一。机械性能良好，在较高层析流速下，分辨率并不受影响，其缺点是对蛋白质等物质有吸附能力聚苯乙烯凝胶五、其他23/70第二节基本原理24/70一、基本原理

凝胶过滤层析所用基质是含有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒物质。这种物质可完全或部分排阻一些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则能够在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻程度用表示

洗脱体积；外水体积；凝胶床体积

在一定层析条件下，和均为固定值，而伴随被分离物分子量改变而改变。组分分子量越大，则洗脱更轻易（排阻越多），越小，越小25/70

各组分间值差异越大，分离效果越好；差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离流出物用部分搜集器等量或等时搜集，检测后分段合并相同组分各管流出物，得到分子量不一样各种组分26/70

1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗透凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分Ⅲ）27/703、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗透，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间改变（图中组分Ⅱ）4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。比如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中洗脱体积远超出理论计算最大值28/70二、值测定只要测出、和，即可计算出值测定：（1）计算法：（2）测定法：29/70

测定：用蓝色葡聚糖（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积测定：用、N-乙酰酪氨酸或其它小分子物质作为洗脱对象。因为分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是（=1）当分子大小在凝胶孔径上、下限之间时，则介于和之间（即=0~1）30/7031/70第三节操作32/70（一）凝胶选择

1.型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：SephadexG型多用于分离蛋白质；生物胶和Sephacryl等多用于分离核酸；要除去蛋白质中盐类，多用SephadexG-252.粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径层析柱

一、凝胶选择与处理33/7034/70（二）凝胶用量计算

因为凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出凝胶用量需增加10~20%35/70（三）凝胶处理将所用干胶置于5~10倍量D.W中，充分浸泡（表6-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡0.5h，抽滤除去碱液，用D.W洗至中性。再用抽气方法以D.W或平衡液除去凝胶颗粒之间气泡36/701．柱子选择①当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高②柱长相同时，直径大者比小者分辨率高③床体积相同时，柱长长者比短分辨率高

普通理想层析柱直径与长度之比是1：25~1：100；层析柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱），以确保结果重复性2．装柱：惯用湿装法（第三章）3．凝胶柱判定

二、凝胶柱制备37/70流速、柱长对分离影响

38/70加样量与层析柱床体积及检测方法灵敏度相关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少层析目标在于分析时，加样量占床体积1～2％，作制备、脱盐用时，占20～30％普通来说，加样量越少，分辨率越高。详细加样体积由分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定三、加样与洗脱（一）加样39/7040/70

VeA、VeB：组分A、B洗脱体积

KavA、KavB：组分A、B分配系数Vs：A、B两组分洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs=VeA－VeB

当样品体积Vp＝Vs时，理论上洗脱图形是两种物质恰好分开(图中Ⅲ)。但因为样品流过柱时扩散作用，其体积会逐步增大，致使其洗脱体积远比原来大加样量（Vp）确定41/70

图Ⅱ、Ⅲ中A、B两种物质有一定程度交叉，这表明二者只是部分分开。所以，当Vp等于或大于Vs时，A、B两种物质就不能完全分开(图中Ⅱ)

当Vp＜Vs时，A、B两种物质就能分开(图中Ⅰ)

依据Ve=Vo+Kav（Vt－Vo）又Vs=VeA－VeB

=（KavA－KavB）（Vt－Vo）42/70

Vs=（KavA－KavB）（Vt－Vo）=（KavA－KavB）（Vi+Vg）

A、B两种物质能分开最低限：Vp＝Vs最大Vs时必要条件：①KavA－KavB最大，为1－0＝1②Vi+Vg最大，普通为Vt/2则：最大理论加样量Vp＝Vs＝Vt/2

最大理论加样量计算43/70

为提升分离效果，除了缩小加样体积以外，样品黏度也普通以小于2cp(厘帕，P=N/m2·s)，或者与洗脱液黏度相当为宜葡聚糖使粘度上升

黏度影响44/70粘度对柱层析影响

45/701.洗脱液选择标准

能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活普通以单一缓冲液（如PBS、Tris-HCl缓冲液等）或盐溶液，有时甚至用D.W作为洗脱液2.洗脱速度

若流速不均匀，搜集每一部分洗脱体积不恒定，Kav就难以确定最好装置是恒流泵(微量泵、蠕动泵)，能够使流速在较大范围内恒定。若无此装置，可用控制操作压方法进行，其装置可使用恒压瓶

普通，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，由会因扩散加剧而影响分离效果(二)洗脱46/70。47/70

SephadexG-50及其以下（交联度大）流速与操作压之间关系恪守Darcy’s规律u：线性流速(ml/cm2·h)K：常数(粗、中、细颗粒各不相同)△P：操作压(cp)L：柱长流速与操作压48/70

Ko仅与凝胶性质相关，而与柱子直径基本无关。不过G-75以上各种型号交联葡聚糖流速还与柱直径大小相关

当洗脱液黏度为lcp时表示式49/7050/70

普通，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果51/70四、凝胶柱再生及保留（一）再生

使用过一次或几次凝胶柱，通惯用3～4倍床体积洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过屡次后，凝胶床体积变小、流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是

①先用水重复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；

②把凝胶倒出，用低浓度酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱52/70①膨胀状态即在水相中保留。可加入0.02%叠氮钠（NaN3）溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保留。普通不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引发凝胶颗粒收缩，同时还能进入层析仪器塑料部件，使塑料变软，造成不良后果（二）保存53/7054/70②半收缩状态：

用完后水洗净，然后再用60%～70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温较长时间保留③干燥状态：

用水洗净后，加入含乙醇水洗，并逐步加大含醇量，最终用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60～80℃烘干后长时间保留

不脱水而直接烘干会黏结成块

55/70第四节应用56/70原理：盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外（分子筛原理）优点：与透析相比，速度快，不会引发大分子物质变性材料：细颗粒葡聚糖凝胶G-25

一、脱盐和浓缩57/70分离对象：溶解度、带电性等理化性质相同而分子质量不同，或者是聚合度不等混合物溶液实例：SephadexG-200层析纯化AFP制备Ag-Ab复合物溶于少许0.1mol/LGly-HCl缓冲液中，并用本液透析2h上SephadexG-200柱得AFP峰置0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.8）透析上柱洗脱AFP纯品二、分离生命物质58/7059/7060/70热源物质：指微生物产生分子量很大一些多糖蛋白复合物等，能使人体发烧物质材料：SephadexG-25（80~120目）特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便

实例：用SephadexG-25凝胶层析除去氨基酸粗品中热源质：利用热源（大分子蛋白类）Kav=0，而氨基酸Kav≈1，将试剂量控制在柱体积20~30%，能实现完全分离三、去热源物质61/70原理：Kav=－blgM+c或lgM=a－dKav(M为分子质量，常数a、b、c、d均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav也可用以下4个指标代替①Ve－Vo：分离体积②Ve/Vo：相对保留体积（另R＝Vo/Ve）③Ve/Vt：简化洗脱体积，受柱填充情况影响较小④Ve：洗