植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取(CTAB法)实验原理十六烷基三甲基漠化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。实验材料液氮；研钵；CTABDNA提取液：100mMTris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；20mMEDTA(pH8.0)螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；1.4MNaCl提供一个高盐环境，使DNA蛋白复合物(DNP)充分溶解；2%(w/v)CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；1%PVP40,000(polyvinylpyrrolidone)(聚乙烯毗咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。将上述试剂混合后，灭菌20分钟，常温保存；酚氯仿异戊醇按照酚:氯仿:异戊醇=48:48:4的比例配置［蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1,有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性；氯仿异戊醇按照氯仿:异戊醇=96:4的比例配置。能克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚(酚易溶于氯仿中)；6） 异丙醇沉淀DNA；7） 70%的酒精清洗DNA；8） 2mL与1.5mL的离心管若干。实验步骤1） 收集大约100mg的植物样品，在使用前保存于-80°C。2） 将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个2mL的离心管中。3） 将步骤2中的离心管中加入0.9mLCTAB,漩涡震荡均匀，于65C中水浴20-30分钟。4） 水浴后，加入0.9mL氯仿异戊醇，上下翻转均匀，12000rpm离心8分钟。5） 将离心后上清液（510pL）转至另一干净的1.5mL离心管中，加入340gL（上清液体积的2/3）异丙醇，上下翻转均匀（至有沉淀产生），12000rpm离心8分钟。6） 离心后弃掉液体，用0.7mL70%的酒精清洗，12000rpm离心2分钟，小心地弃掉废液，防止将DNA倒出。7） 重复步骤6。8） 于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。9） 加入50gL灭菌水或TE水（pH8.0TE可延长DNA保存时间），将DNA于-20C、-80C长期保存。注意事项：1） 实验前应先预热水浴锅。2） 在对DNA质量要求不是特别高的情况下，用氯仿异戊醇即可，不用酚氯仿异戊醇。（一）试剂：菌株（E.coli）;蛋白酶K（20mg/ml）;琼脂糖；标准DNA水解液10%SDS2.酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）3.异丙醇；70%乙醇.LB培养基：蛋白腺10g,酵母粉5g,NaCl10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。.TE缓冲液:10mMTris*HCl,0.1mMEDTA（pH8.0）。.CTAB/NaCl溶液（5%w/v）:5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需要加热到65°C使之溶解，然后室温保存。.TAE缓冲液（50x）（pH8.0）:每升溶液中含有242gTris,57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA。电泳时稀释成1x浓度使用。.漠酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%漠酚兰水溶液，然后取1份0.1%漠酚兰溶液与等体积的甘油混合即成.0.5ug/ml漠乙啶染液：称取5mg漠乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5ug/ml。二）器材：锥形瓶（250ml）,1.5ml离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪【实验方法】（一）细菌总DNA的提取1.将菌株接种于液体LB培养基，37°C震荡培养过夜。取1.5ml培养物12000rpm离心2min。沉淀物加入567ul的TE缓冲液反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀，于37C温育1h.加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65C温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.