微生物的营养、生长与代谢-微生物的分离、纯化及培养

微生物学及操作技术微生物的无菌操作技术123目录页CONTENTSPAGE无菌操作技术的概念无菌工作环境的准备无菌操作的技术要点1过渡页TRANSITIONPAGE无菌操作技术的概念1.无菌操作概念2.无菌操作目的无菌操作技术无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。2.实验原理2.无菌操作目的1.无菌操作概念无菌操作技术无菌操作目的2.实验原理2.无菌操作目的1.无菌操作概念一方面保证待测物品不被周围环境微生物污染另一方面防止微生物在操作中污染环境或感染操作人员2无菌环境的要求和保持进入无菌室前的准备无菌操作的要求无菌2.实验原理2.进入无菌室前的准备1.无菌环境的要求与保持3.无菌操作的要求无菌的环境的要求与保持

无菌环境无菌室超净工作台无菌操作技术实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求（1）无菌室的消毒和防污染*无菌室内空气测试应基本达到无菌。*每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.*每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.*每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。*定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖动态。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求1、无菌室无菌室的结构：应有更衣间、缓冲间、操作间应有良好的通风条件，安装空调设备及过滤设备无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求（2）无菌室的消毒和防污染*无菌室内空气测试应基本达到无菌。*每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.*每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.*每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。*定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖动态。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求2、超净台

超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染并保护操作者。原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求超净台使用风速保持在0.32-0.48米/秒使用前打开紫外灯照射40~60min开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布擦拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min.定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求生物安全柜生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人，实验室环境以及实验室材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物设计的。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求3、无菌器材准备灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台等无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求进入无菌室前的准备（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理30~60min；（3）检查无菌器材是否完备；（4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。（5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、鞋。无菌操作技术2.实验原理1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求3.无菌操作的要求（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒内消毒。无菌操作技术微生物学及操作技术微生物的接种技术概念1原理2步骤3目录页CONTENTSPAGE注意事项41

概念过渡页TRANSITIONPAGE实验目的

掌握倒平板、斜面接种、液体接种、穿刺接种、平板接种和各种微生物接种的基本操作技术。概念：按无菌操作技术要求将目的微生物移接到培养基质中的过程。2原理无菌操作技术无菌操作材料：实验原理2.实验原理接种工具：1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀3步骤接种前的准备工作接种操作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求（1）无菌室的消毒和防污染*无菌室内空气测试应基本达到无菌。*每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.*每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.*每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。*定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖动态。一、接种前的准备工作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求2.超净台风速保持在0.32-0.48米/秒使用前打开紫外灯照射40~60min开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布擦拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min.定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。一、接种前的准备工作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求一、接种前的准备工作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求3、无菌器材准备灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台等一、接种前的准备工作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求进入无菌室前的准备（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理30~60min；（3）检查无菌器材是否完备；（4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。（5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、鞋。一、接种前的准备工作实验步骤1.无菌环境的要求与保持2.进入无菌室前的准备3.无菌操作的要求4.无菌操作的要求（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒内消毒。一、接种前的准备工作倒平板的方法将培养基加热融化，待冷却至55－600C时，倒平板。二、接种操作3.液体接种2.斜面接种1.倒平板的方法4.穿刺接种5.平板接种实验步骤斜面接种：

从已长好微生物移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。3.液体接种1.倒平板的方法2.斜面接种4.穿刺接种5.平板接种二、接种操作实验步骤试管斜面接种1.两支试管呈“V”字形

2.拔下试管塞3.火焰上微烧一周

4.接种环灼烧、冷却5.接种、划线6.塞上塞子，灼烧接种环3.液体接种1.倒平板的方法2.斜面接种4.穿刺接种5.平板接种二、接种操作实验步骤

液体接种：将菌接种到液体培养基（试管、三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或接种环接种。1.倒平板的方法2.斜面接种3.液体接种4.穿刺接种5.平板接种二、接种操作实验步骤1.倒平板的方法2.斜面接种3.液体接种4.穿刺接种5.平板接种二、接种操作实验步骤穿刺接种：

用接种针挑取菌种后，插入深层固体（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。3.液体接种2.斜面接种4.穿刺接种1.倒平板的方法5.平板接种二、接种操作实验步骤3.液体接种2.斜面接种4.穿刺接种1.倒平板的方法5.平板接种二、接种操作实验步骤平板接种：

将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：

3.液体接种2.斜面接种5.平板接种4.穿刺接种1.倒平板的方法二、接种操作实验步骤(1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面即可。

（2）平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。

3.液体接种2.斜面接种5.平板接种4.穿刺接种1.倒平板的方法二、接种操作实验步骤（3）平板涂布法倒培养基，制成平板。凝固后，另取一支吸管吸取相应的菌液0.2mL放至平板上。用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于37℃条件下培养1～2d，观察菌落形态及计数菌落。3.液体接种2.斜面接种5.平板接种4.穿刺接种1.倒平板的方法二、接种操作实验步骤37℃培养接种操作实验步骤3.液体接种2.斜面接种5.平板接种4.穿刺接种1.倒平板的方法倒平板吸管取菌液平板涂布微生物学及操作技术微生物的分离技术目录页CONTENTSPAGE1比较和识别四种微生物菌落形态3目的和概念分离的三种方法21过渡页TRANSITIONPAGE目的与概念目的概念为什么要进行分离和纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。这些菌落分离出来，进行纯培养。所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。2过渡页TRANSITIONPAGE微生物的三种分离方法稀释平板法平板涂抹法平板划线法1.用稀释平板法分离2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法

1）无菌操作法稀释样品

2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法2）接种，接入合适的菌液，取已熔化的在水浴锅中保温45－500C左右的培养基，分别倒入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于恒温培养。2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法2.用平板涂抹法（以金黄色葡萄球菌平板计数法为例）1.倒平板

将培养基加热融化，待冷至55～60℃时，右手持三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，然后平置于桌面上，静置凝固。2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法2.待平板凝固后加入菌液2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法

2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法

2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法3.用平板划线法分离（以沙门氏菌平板划线分离为例）

1.制好无菌平板

2.凝固后，用接种环取相应的菌液一环在平板上划线。

连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。

三区划线或四区划线2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法2.平板涂抹法1.稀释平板法3.平板划线法3过渡页TRANSITIONPAGE比较和识别四大类微生物的菌落形态细菌酵母菌霉菌放线菌区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。菌落形态：菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。细胞形态：细菌——小而分散酵母菌——大而分散放线菌——丝状细霉菌——丝状粗从不同平板上选择不同类型的菌落进行肉眼观察，从如下方面进行描述

大小：直径范围

形状：圆形、不规则形、根足形等

颜色：分正面、反面

边缘：整齐、锯齿状、丝网状、放射状等

光泽：润泽或干燥，透明、不透明或半透明

质地：平滑致密或粗糙疏松，与培养基结合紧密度

有无特殊形态如皱襞、旋涡状、荷包蛋状

隆起：程度分扁平、隆起、内陷等2.霉菌1.细菌

3.放线菌

细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致，边缘一般看不到细胞，与培养基不结合，颜色多样，菌落外观形态小而凸起或大而平坦，菌落透明或稍透明。细菌的细胞相互关系是单个分散或有一定的排列方式的。它的形态特征是小二而均匀，个别有芽孢。细胞生长速度一般很快，细菌一般有臭味。4.酵母菌2.霉菌1.细菌

3.放线菌

4.酵母菌多种细菌菌落2.霉菌1.细菌

3.放线菌

霉菌的菌丝较粗而长，菌落较大，菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致，颜色多样。菌落边缘可见粗丝状细胞。细胞相互关系是丝状交织，形态特征粗而分化，细胞一般生长较快，气味往往有霉味。4.酵母菌2.霉菌1.细菌

3.放线菌

4.酵母菌霉菌菌落2.霉菌1.细菌

3.放线菌

放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。细胞相互关系是丝状交织，形态特征细而均匀，生长速度慢，常有泥腥味。4.酵母菌2.霉菌1.细菌

3.放线菌4.酵母菌放线菌菌落2.霉菌1.细菌

3.放线菌

4.酵母菌大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而凸起，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色，菌落稍透明，不与培养基结合。菌落边缘可见球状，卵圆状或假丝状细胞。气味多带酒香味。细胞相互关系

多种酵母菌菌落微生物的培养技术微生物的营养、生长与代谢固态发酵技术2目录页CONTENTSPAGE微生物发酵工业1液态发酵技术31微生物发酵工业发酵工业发酵工程过渡页TRANSITIONPAGE一、微生物发酵工业微生物的培养技术2.发酵工程1.发酵工业微生物的培养技术1.发酵工业2.发酵工程一、微生物发酵工业2微生物固态发酵技术固态发酵概述固态发酵的基本过程