质谱在蛋白组学中的应用

质谱在蛋白组学中的应用

1相对定量方法现在，蛋白质组的研究重点和研究趋势已从定性分析转向定量分析。定量蛋白质组学是对细胞、组织乃至完整生物体的蛋白质表达进行定量分析,对生物过程机理的探索和临床诊断标志物的发现与验证具有重要意义。定量蛋白质组学分为相对定量与绝对定量。相对定量即差异比较,通过质谱大规模、高通量地对两种或多种不同生理、病理条件下的样本进行定量分析,获得蛋白质表达量的精确差异,主要方法有稳定同位素标记和非标记两种技术手段。绝对定量即获得蛋白的具体表达量,利用质谱监测目标蛋白的专一性肽段(UniquePeptide)获得色谱-质谱峰面积,并与已知量的标准肽段(外标法)或稳定同位素标记的重标肽段(内标法)比较确定具体量,实现绝对定量。主要质谱方法是对专一性肽段进行选择反应监测或称多反应监测(Selected/Multiplereactionmonitoring,SRM/MRM)。稳定同位素标记技术是蛋白质组学相对定量的经典方法。样本在稳定同位素标记后、质谱分析前混合,一次分析实现差异定量,有效消除了色谱和质谱分离分析过程中的不稳定性,最大程度减小了定量误差。常见方法有基于代谢标记的SILAC、基于酶解标记的18O标记和基于化学标记的二甲基化等,这些方法通过一级母离子提取峰面积实现定量比较。但是,一级定量具有标记通量低、动态范围差、灵敏度不高等不足,因此,近年来,基于同重同位素标记的二级定量方法使用越来越广泛。利用同重同位素标签标记肽段,在一级质谱不同样本的肽段分子量没有区分,相互叠加,提高了灵敏度;二级碎裂获得分子量不同的报告离子,在b/y离子定性的同时,通过报告离子之间的强度差异实现定量,提高了动态范围。同重同位素主要标记试剂有iTRAQ和TMT,标签容量分别达到了8标和6标。然而,同重同位素标记技术面临共洗脱肽段干扰的问题。蛋白质组学样本非常复杂,在色谱上存在大量共洗脱肽段,而质谱在选择母离子进行二级分析时,选择窗口通常在m/z2左右,分子量接近的共洗脱肽段被同时选择,碎裂出的报告离子与目标肽段报告离子叠加,降低了定量比例的准确性。Ting等研究证明,在复杂样本中,共洗脱肽段严重干扰了报告离子的强度,造成肽段和蛋白的定量比例低于真实比例,产生“低估效应”。这一问题已成为同重同位素标记定量技术的瓶颈。基于三重四极杆的SRM(或称MRM)是质谱定量的金标准,在蛋白质绝对定量中也广泛使用。SRM根据专一性肽段的母离子质量和子离子质量,第一级质量分析器(Q1)筛选母离子,进入碰撞池碎裂后,第二级质量分析器(Q3)再筛选子离子,最大程度地去除干扰离子,监测母离子-子离子形成的离子对的信号响应。通过外标法,利用已知量的标准肽段绘制标准曲线;或内标法,直接加入已知量的同位素重标肽段同时监测,从而实现定性确证和定量检测。SRM灵敏度高、线性范围广,是目标蛋白验证和绝对定量的有效手段。然而,随着定量蛋白质组学的深入发展,样本基质越来越复杂、目标蛋白丰度越来越低,容易受到高丰度蛋白的掩盖。而SRM由于质量分辨率低,难以有效去除复杂基质背景的干扰,易造成假阳性。另一方面,随着分析通量的要求越来越高,一次分析可能需要监测成千上万个离子对,而SRM速度和灵敏度的局限使得能同时监测的离子对数量有限;此外,离子对、碰撞能量等条件的优化也费时费力,难以满足目标蛋白质组学高通量发展的需要,特别是大样本量的生物标志物和系统生物学研究。因此,蛋白质绝对定量同样面临着较大的技术挑战。近两年来,随着以Orbitrap为代表的高分辨质谱硬件技术不断进步、采集方法不断创新,定量蛋白质组学遇到的诸多瓶颈正逐步得到解决。这些技术包括基于同重同位素标记技术的同步母离子选择和质量亏损标记,相对于传统SRM扫描的高分辨平行反应监测和多重累积-平行反应监测,以及多种全新数据非依赖性采集技术。2u3000结论以iTRAQ和TMT为代表的同重同位素标记技术面临着两方面的技术瓶颈:(1)大量共洗脱肽段对定量准确性的影响:分子量接近的共洗脱肽段与目标肽段共同选择并碎裂,报告离子叠加,造成实际定量比例不能准确反映真实结果[13~15];(2)等重同位素标签通量有限:以iTRAQ为例,其报告基团(N-methylpiperazine)由6个C和2个N组成,因此容量上限为8标,无法完成更高通量样本的分析。而通过增大报告基团来提升标签容量又会造成灵敏度的下降。为解决共洗脱肽段干扰的问题,Ting等使用LTQ-Orbitrap进行MS3扫描,对TMT标记的样本进行分析(图1)。其中MS2使用能量较低的CID(35%)碎裂,获得b/y离子碎片用于序列鉴定,同时确保了TMT标签不会过多碎裂。在母离子m/z110~160%的范围内,选择最强的一个碎片离子,进行高能量HCD(60%)碎裂和MS3检测,使报告基团充分碎裂,获得报告离子比例信息。结果表明,通过母离子和子离子双重筛选,共洗脱肽段的干扰能够被彻底去除,获得的定量比例与理论比例一致。例如,在掺入等比例人源蛋白的不同比例酵母全蛋白样本中,理论比值为10∶1,传统MS2测得的比值仅约为3,而MS3测的比值为11.7,与理论比值非常接近。但是与传统MS2方法相比,MS3信号强度明显降低。因此,虽然MS3的定量准确度大大提高,但定量灵敏度却明显下降,也使得MS3定量方法并没有普遍应用到实际分析中。此外,近来发展的TMT互补离子(TMTc)和QuantMode等技术虽然也能降低共洗脱肽段的干扰,但过程较为繁琐,准确度无法与MS3方法相媲美。同步母离子选择(Synchronousprecursorselection,SPS)技术的出现彻底解决了MS3响应弱的问题。SPS技术利用多频切迹的选择波形电压(MultiNotch),在线性离子阱中实现一次选择同时获得多个离子,最多可同时选择15个(图2A)。利用这一原理,SPS技术在MS2中同时选择目标肽段的多个b/y碎片进行MS3分析,产生的报告离子相累积,使MS3信号响应大幅提高(图2B)。实验结果表明,使用SPS进行MS3定量分析,即二级CID碎裂,并同时选择多个碎片离子进行三级HCD碎裂和Orbitrap检测,获得的MS3谱图响应与传统MS2谱图相当,定量成功率超过70%,与传统MS2定量结果相当(图2C)。同时,多个碎片报告基团的叠加相比传统MS3单个碎片报告基团,得到的比值更加稳定,定量重现性和准确度进一步增加(图2D)。此外,相比传统方法,MS3定量方法只能用于Lys-C酶解样品,SPSMS3定量方法适用于广泛使用的Trypsin酶解样品,能更普遍用于常规定量蛋白质组学。Weekes等使用SPSMS3技术定量研究了巨细胞病毒(CMV)感染纤维母细胞的过程和机理,获得超过8000个蛋白(包括1184个细胞表面蛋白)在8个时间点感染过程中的精确定量变化,实现了实时动态定量分析,开创了定量时序病毒组学(QuantitativeTemporalViromics)领域的先河。对于同重同位素标签通量的限制,Dephoure等尝试使用3标SILAC结合6标TMT,同时定量18组平行样本,取得了良好的效果。而近年来,质量亏损标记技术的运用,从根本上拓展了报告基团的标签容量。13C和12C、15N和14N之间因核结合能形成质量亏损,巧妙利用13C14N与12C15N之间6.32mDa的微小质量差,通过13C与15N相互替换,即可实现标签容量上限的突破(图3A)。例如,将TMT6标中TMT127、TMT129报告基团上一个13C替换成15N,形成TMT127L(12C8H1615N1+,127.1247608Da)/TMT127H(12C713C1H1614N1+,127.1310808Da),TMT129L(12C613C2H1615N1+,129.1314705Da)/TMT129H(12C513C3H1614N1+,129.1377904Da),标签容量提升至8标。类似地,在不改变报告基团结构的情况下,TMT10标、TMT18标均得以实现,有效解决了多组平行样本的定量分析问题。但是另一方面,6.32mDa的质量差异需要质谱在m/z100~200范围达到50000以上的分辨率才能实现基线分辨(图3B),普通高分辨质谱难以胜任。而基于傅里叶变换原理的超高分辨Orbitrap和FT-ICR,分辨率与m/z成反比,能够轻松分辨m/z100~200的质量亏损标签。目前,基于质量亏损标记的TMT10标已经商品化,广泛应用于系统生物学和临床标志物研究等大样本量的定量蛋白质组学(图3C)。近年来,以同步母离子选择SPS和质量亏损标记为代表的新技术的发展,使得传统同重同位素标记定量面临的诸多问题正逐步获得解决,成为蛋白质组学相对定量的有力工具和发展趋势。3平行反应监测SRM使用低分辨四极杆进行两级离子筛选和监测,在小分子分析中能有效区分目标化合物和基质背景,因为小分子的化学结构通常差异较大。然而在蛋白质组学中,由于肽段性质的相似性,SRM难以完全排除复杂样本的背景离子,容易受到较大干扰,影响蛋白绝对定量的准确性和专一性。此外,SRM还需要花费相当的精力进行离子对的选择和优化。质谱技术的改进也为SRM带来改善。高分辨SRM(H-SRM)将四极杆的母离子选择窗口从传统的m/z0.7缩小到m/z0.2,从而有效地降低基质背景的干扰。然而,选择窗口缩小也同时降低了选择效率,因此该技术更多应用于小分子分析。此外,通过增加第三级质量筛选形成三级MRM(MRM3)扫描,也有效提高了选择性。但是MRM3面临着同样的问题,额外一级离子筛选降低了检测灵敏度,同时也增加了循环时间。四极杆-高分辨串联质谱技术的发展和扫描速度的提升,为目标蛋白定量提供了新的途径。平行反应监测(Parallelreactionmonitoring,PRM)正是相对于传统SRM建立起来的高分辨离子监测技术。PRM基于以Q-Orbitrap为代表四极杆-高分辨质谱平台,与SRM每次扫描一个Transition不同,PRM每次对一个母离子产生的所有Transition进行全扫描,即平行监测了一个母离子对应的所有离子对。首先,PRM使用四极杆(Q1)选择母离子,选择窗口通常m/z≤2;然后,母离子在碰撞池(Q2)中碎裂,形成子离子;最后,以Orbitrap取代Q3,对所有子离子进行高分辨/高质量精度(HR/AM)的全扫描,完成PRM采集(图4)。相比传统的SRM,PRM的优势在于:(1)高分辨子离子监测,质量精度达ppm级(通常外标法<3ppm,内标法<1ppm),在不损失灵敏度的情况下,最大程度地排除了背景干扰;(2)二级为全扫描,无需事先确定离子对和优化碰撞能量,只需要在数据处理时选择响应最高的一个或几个子离子,即可提取母子离子对的色谱峰进行定量,线性范围可达5~6个数量级;(3)同时定性与定量分析,二级全扫描谱图用于定性分析,选择其中最佳的子离子提取离子对即可完成定量分析。然而PRM的分析通量不如SRM。PRM能同时监测最多10~15个母离子,而SRM能同时监测上百个离子对,因为高分辨质谱的有效扫描速度通常只有10~15Hz,远慢于SRM的有效扫描速度。但是这一问题正逐步得到解决,多重累积(Multiplexing,MSX)技术的发展和使用有效提高了PRM的分析通量。多重累积利用Orbitrap前端的C型阱(C-trap),不同质量的母离子依次被四极杆选择并储存于C-trap中,等待Orbitrap完成上次扫描后,C-trap中储存的混合离子同时注入到Orbitrap中进行扫描,实现最多10个目标物的同时监测,分析通量最高可提升10倍。Gallien等将多重累积与PRM结合建立MSX-PRM技术,利用4重累积和保留时间分段(1.5~2.5min窗口),在60min液相梯度下,定量监测了酵母全蛋白裂解液中770个目标肽段,对应436种蛋白。其中,同一保留时间下的肽段数量最高达60个,在这种情况下,循环时间保持在2s以下,分析通量达到SRM的水平。此外,通过优化分辨率、离子注入时间等参数,目标肽段分析通量还能进一步提高:在MSX设为8时,同时监测的肽段数量可达128个。综上所述,高分辨PRM和MSX-PRM技术的出现,解决了传统SRM技术在定量蛋白质组学方面存在的诸多不足,为复杂样本中目标蛋白的验证和绝对定量提供了有效手段。4基于新认识的dia定量分析基于数据依赖性采集(Datadependentacquisition,DDA)的鸟枪法(Shotgun)是蛋白质组学的经典策略,也是蛋白质组学相对定量的主要技术手段。DDA二级采集取决于一级扫描结果,易造成低丰度肽段的丢失,具有一定的随机性,扫描点数也不均匀。而SRM等目标采集方法不能采集非目标肽段,而且分析通量有限。近年来发展的数据非依赖性采集(Dataindependentacquisition,DIA)结合了DDA与SRM的特点,将整个扫描范围等分为若干窗口,每个窗口依次选择、碎裂,采集窗口内所有母离子的全部子离子信息。DIA无需指定目标肽段,通量无上限,扫描点数均匀,利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选,同时数据可以回溯,相比传统DDA和SRM具有明显优势。Venable等使用线性离子阱(LTQ),以10m/z窗口步长依次选择、碎裂、采集,对15N标记的酵母全蛋白样品进行相对定量分析,开创了DIA应用的先河。结果表明,通过DIA提取的色谱峰,其信噪比、重现性和定量准确性均明显优于DDA,蛋白定量数量增加了87%。Gillet等基于Q-TOF(TripleTOF),采用32个连续的m/z25窗口建立SWATH技术,并证明SWATH的选择性与SRM相当。SWATH的发展使DIA越来越多地应用于定量蛋白质组学[50~52]。同时,基于Q-Orbitrap(QExactive)的DIA技术,同样使用25m/z步长,通过更高的分辨率,使复杂样本定量的选择性进一步提高。此外,诸如MSE、AIF等质量范围不分段的DIA方法在蛋白定量中也有所应用,但由于这些方法不进行质量分段选择,而是将所有离子同时碎裂、检测,基质干扰较为严重,难以胜任复杂样本的定量分析。然而,由于扫描速度的限制,基于高分辨质谱的DIA通常需要以m/z25的大窗口步长分段,以确保获得足够的扫描点数进行定量。而m/z25的选择窗口仍然会引入较多的干扰离子,影响DIA的定量分析效果(图6A)。近来,全新DIA技术的发展使DIA的选择窗口不断缩小,DIA定量选择性、灵敏度和重现性进一步提高。其中,前文提到的多重累积技术已应用到DIA中,Egertson等利用Q-Orbitrap的多重累积功能发展了MSX-DIA技术,随机将5个m/z4窗口依次选择、累积,然后同时注入Orbitrap进行扫描。MSX-DIA总步长仍然是m/z20,不影响扫描速度,而m/z20由5段独立的窗口组成,实际选择窗口仅m/z4(图6A)。数据利用Skyline软件去卷积,即可将每个碎片归属到特定窗口中,实现m/z4窗口的选择性(图6B)。MSX-DIA的选择性已接近DDA,最大程度减少了共流出肽段和杂质的干扰。Q-OT-qIT三合一质谱技术的出现为提高DIA性能带来了更多可能。利用Q-OT-qIT中Orbitrap和线性离子阱互不干扰、平行工作的特点,使Orbitrap专门进行一级扫描,线性离子阱专门进行二级DIA扫描,线性离子阱扫描速度达20Hz,比高分辨扫描更快。然后,使用一级超高分辨谱图进行母离子色谱峰的精确提取和定量,二级谱图只用于确证、不用于定量。因此,整体扫描速度明显增加,同时二级DIA扫描又无需关注扫描点数,为进一步缩小选择窗口带来可能。WiSIM-DIA和FullMS-DIA正是基于这种模式建立的DIA技术(图7)。WiSIM-DIA将m/z200宽窗口一级选择离子监测扫描(Wideisolationwindow-SIM)与m/z12窗口步长的二级离子阱全扫描相结合,24万分辨率的宽窗口SIM扫描有效提高了母离子的选择性,利用母离子精确质量提取色谱峰进行定量,相比经典DIA的子离子定量灵敏度更高(图7A)。同时,利用二级谱图实现肽段定性确证。虽然与经典DIA相比,WiSIM-DIA二级为低分辨谱图,但选择窗口从m/z25缩小到了m/z12,能有效减少基质背景的干扰。更进一步,FullMS-DIA以m/z3步长进行二级采集,并插入若干24万分辨率的一级全扫描保证母离子扫描点数,与WiSIM-DIA一样,利用一级母离子定量、二级子离子定性(图7B)。值得注意的是,FullMS-DIA将选择窗口缩小到仅m/z3,其选择性与DDA相当,数据可以直接作为低分辨谱图(母离子±1.5Da质量精度)进行数据库检索,鉴定结果与DDA高度吻合,首次使DIA摆脱了依赖于谱图库的局限,初步实现了DIA与DDA的统一。当然,DIA数据直接进行数据库检索的算法和卡值方法也已出现,很快就会应用到DIA中,从而使DIA和DDA一样可以直接搜库鉴定,彻底摆脱谱图库的限制,已有数据证明DIA能够获得比DDA更多的鉴定结果。此外,最近发展的pSMART技术,利用m/z5步长进行二级Orbitrap扫描,并在扫描范围内插入若干一级超高分辨Orbitrap扫描,在Q-Orbitrap平台上实现了类似WiSIM-DIA的采集技术。结果显示,无论是定性还是定量分析,pSMART的灵敏度、选择性和重现性都要明显优于传统DIA。无论是相对定量还是绝对定量方法,DIA很好地克服了DDA鸟枪法和SRM目标监测的种种不足,在定量蛋白质组学中具有良好的应用前景。然而,目前DIA方法的循环时间仍然较长,只能与纳流液相联用,并使用较长的梯度以获得足够的色谱峰宽,限制了DIA的应用范围。这也是DIA技术下一步需要解决的问题。5定定量蛋白质组学基于报告离子