大肠杆菌表达系统中外源蛋白的分离与纯化

大肠杆菌表达系统中外源蛋白的分离与纯化

自20世纪90年代以来，基因重组技术取得了很大进展，越来越多的订单细菌（或工程细胞）被建立。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。大肠杆菌由于遗传背景清楚,容易培养以及有大量可供选择的克隆载体与表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要细菌。然而,在实践过程中,一个十分棘手的问题是许多外源基因在大肠杆菌、酵母等表达体系中表达时,往往以包涵体形式存在,高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。一般含有50%(质量分数)以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白、环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5～1μm,具有很高的密度(约为1.3mg/ml),无定形,非水溶性,可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。因此如何分离纯化这些工程菌所表达的重组蛋白则是基因工程技术产业化所面临的重要问题。这一工艺过程复杂,需要较高的技术和先进的设备条件,且无固定模式可以借鉴,主要靠经验和实践摸索,具有很高的挑战性。1在复合营养方面的问题(1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠,导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明,包涵体是由部分变性的中间体聚合而成。因此,任何影响中间体稳定的因素,如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。(7)有报道认为,丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体。2蛋白水解酶的作用包涵体的形成具有有利的一面,也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白的10%～30%,甚至高达50%。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂,而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性的操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀,有些还形成异构体。因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。包涵体的处理一般有如下几个步聚。2.1单因素处理法分离可溶性蛋白提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适的缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加入保护剂,如还原剂DDT(2-巯基苏糖醇)、2-巯基乙醇;加2.2洗涤包涵体洗涤包涵体前先8000r/min,4℃离心15min,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。为了除去包涵体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,利用洗涤液洗涤包涵体沉淀,常用去污剂Tritonx-100或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂(如2mol/L尿素或盐酸胍等)洗涤以除去脂类,但过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解。2.3还原剂和尿素包涵体一般只溶于强的变性剂如尿素、盐酸胍,它是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT),常用浓度2～10mM。另外,尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,所需浓度尿素6～8M,盐酸胍5～7M。一般来讲,盐酸胍溶解力强于尿素,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,但缺点是容易使SDS电泳条带变形。尿素的溶解度为70%～90%,其分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性pH值下长期保温时,但用尿素溶解具有不电离,呈中性,成本低,蛋白质复性后除去尿素不会造成大量蛋白质沉淀,以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点,故目前已被广泛采用。2.4复性中蛋白的复性过程由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,从4M开始,到1.5M时复性过程结束。包涵体蛋白的复性是一个非常复杂的过程,除与控制蛋白质复性的过程相关外,还在很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法,很多蛋白的复性效率只有百分之几,一般说来,蛋白质的复性效率在20%左右。复性中常采用的方法有以下几种:(1)稀释复性法,直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。(2)透析复性法,好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。(3)超滤复性,在生产中较多使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。(4)柱上复性,是最近研究较多并成功地在生产中应用的一种复性方法,常用于复性的层析方法有疏水层析(HIC)法、亲和层析(AFC)法等。3新型设备在制剂中的应用关于包涵体形成的具体因素一