重组蛋白技术的研究进展

重组蛋白技术的研究进展

蠕虫是第一个用于重组蛋白生产的主要症状。它不仅具有简单的遗传背景、简单的操作、高效的转化和转导率、快速生长和繁殖的优势，而且能够快速生产出目的蛋白质。此外，其表达的外部基因含量远高于其他遗传因素的表达系统，所表达的目的蛋白质含量可能超过细菌总蛋白含量的30%。因此，蘑菇是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。本文主要对大肠杆菌表达系统的组成以及影响外源基因在大肠杆菌系统中表达的因素作一综述,同时对最常用的pET表达系统也作了简要的介绍。1演唱系统的组成1.1外源基因的控制在设计重组表达系统时,有许多主要的元件是必需的。对于一个完整的表达载体来说,除了插入的基因片段外,还应该包括复制起点、选择性筛选标记、启动子以及转录终止子。目前已经构建了多种原核表达载体,通常对原核表达载体的要求是:①转录起始必需的启动子。由于真核基因启动子不能为大肠杆菌RNA多聚酶所识别,因此在进行真核基因表达时,必须将该基因编码区的序列置于大肠杆菌RNA多聚酶所能识别的启动子控制之下;②外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用,影响大肠杆菌的生长,所以表达载体应带有诱导性表达所需要的元件,即有操纵子序列以及与之相应的调控基因等;③翻译起始所必需的核糖体识别序列,一般认为其核心序列SD序列与外源基因起始密码子之间间隔7~13bp时翻译起始效率最高;④外源基因需要插入到载体合适的位置上,所以表达载体要有合适的多克隆位点;⑤基因克隆及筛选的必备条件,包括载体在细胞中复制必需的复制起始序列、抗性筛选标记等。1.1.1启动子的选择启动子是DNA上RNA聚合酶的识别与结合位点。它包括两小段核甘酸序列,即-35区的TTGACA和-10区的TATAAT,它不仅决定转录的起始位点,而且决定转录的起始效率,是影响外源基因表达水平的关键因素。一个启动子的强度取决于它与RNA聚合酶的亲和性以及转录起始复合物的异构化速度,而-35区和-10区顺序是启动子的结构要素,决定了其强弱。由于外源基因的表达往往会影响宿主细胞的生长和繁殖,有些表达产物甚至对细菌有毒性作用,造成死亡和裂解,影响表达水平,目前选用的启动子多为可控制表达,主要包括温度诱导和IPTG诱导表达。常用的启动子有:PL、PR、Ptrp、Ptac、Plac等,还有后来出现的几种高效和特异性的启动子如:T7启动子、ara启动子、cadA启动子等(见表1)。这些启动子在诱导前基础表达水平很低或没有,当细菌生长到一定时期进行诱导表达。用于在E.coli中表达重组蛋白的理想启动子不仅要能指导高效转录,保证目的蛋白的高产量,而且还应被紧密调控,以最大限度降低细菌的代谢负荷和外源蛋白的毒性作用。这种启动子通常是可诱导的,如加入低成本的化学物质或改变生长条件等。1.1.2生物序列的互补性即核糖体结合位点,它是位于起始密码子ATG上游3~10bp处的由3~9bp组成富含嘌呤核苷酸的序列。这段序列刚好与16SrRNA3’末端的富含嘧啶的序列互补结合而起始翻译过程,于1974年由Shine和Dalgarno发现而命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。原核生物中,核糖体受SD序列引导从而识别AUG起始密码,保守区为5’-UAAGGAGGUGA-3’。SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离决定了RBS的结合强度,从而对翻译的效率有显著影响,在设计的时候要注意,SD与AUG之间相距一般以4~10个核苷酸为佳。1.1.3转录终止子的作用原理在原核细胞中,转录终止子根据其作用机制可以分为两类:依赖ρ因子的终止子和不依赖ρ因子的终止子。它是位于基因下游附近的一段序列,使得转录出的mRNA尽可能的短,特别是对于象PL、T7等强启动子的控制更为重要,防止通读甚至几圈的通读,以减少不必要的能量和原料的损耗,提高转录效率。转录终止子具有多种重要的功能,把转录终止子置于基因编码序列下游的合适位置,它可以通过其他启动子而阻止基因的连续转录。此外,转录终止子还可以形成稳定的茎-环结构增加mRNA的稳定性,提高重组蛋白的产量。1.2基因的自适应外源基因是指在大肠杆菌表达体系中所要表达的目的基因,包括原核基因和真核基因两大类。其中原核基因可以在大肠杆菌中直接表达,而真核基因与原核基因不同,它是断裂基因,基因组DNA中的基因是不连续的,含有内含子序列,大肠杆菌对转录出的前体mRNA不能进行剪切形成有功能的mRNA,故不能在大肠杆菌中直接表达,而只能以cDNA的形式在大肠杆菌中表达。而且由于真核转录和翻译元件不能为大肠杆菌识别,必须提供大肠杆菌识别的转录及翻译元件以保证真核基因的表达。如真核基因的前导肽不能被大肠杆菌识别发生正确的剪切,因此在设计真核基因时应去除前导肽序列,必要时换以原核的信号肽序列。真核基因产物除带有前导肽外,许多蛋白质都是以无活性的前体蛋白的形式表达,通过翻译后的加工才能成为活性状态,因此在设计基因时应从活性蛋白质编码序列开始。1.3基因表达的组织重构表达宿主菌株的选择也是在原核蛋白表达过程中所必须要综合考虑的很重要的因素。但是在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在。比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的7种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K-12衍生菌Origami2系列,thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。Rosetta-gamiTM2则是综合上述两类菌株的优点,既补充7种稀有密码子,又能够促进二硫键的形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。OrigamiB是衍生自lacZY突变的BL21菌株,这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物,使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。2不同种外源基因表达效率的差异目前人们运用基因工程技术已在大肠杆菌中成功地表达了许多重要的生物活性蛋白基因,但是由于目的基因结构的多样性,及其与大肠杆菌基因的差异,不同的外源基因在表达效率上有很大的差异。影响外源基因在E.coli中的表达效率因素主要包括:载体(启动子)和宿主菌的选择,密码子的选用,mRNA的稳定性,培养条件的控制和表达产物的后加工处理等。2.1质粒监测液载体表达系统的核心是表达载体。用来在大肠杆菌中表达外源基因的载体有很多种,一般来说,这些载体应满足以下要求:①重组质粒拷贝数高,表达量高;②适用范围广;③表达产物容易纯化;④在菌体内稳定性好。目前已知的应用较广的大肠杆菌表达载体有非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等。2.1.1表达载体的设计其优越性在于表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致,从而可以方便地进行后续研究。为了提高翻译效率,在设计表达载体时采用了许多方法,例如:①优化翻译起始区以达到高效表达;②构建一套SD-AUG间隔不等的表达载体以供选择利用;③在构建表达载体时,使用近年来发现的“原核翻译增强子”序列,以提高翻译效率;④将“原核翻译增强子”和双顺反子结构结合到一起,从而提高表达效率。2.1.2半乳糖苷酶系统表达融合蛋白的一般模式为,原核启动子-SD序列-起始密码子-原核结构基因片断-目的基因序列-终止密码子。目前成功的融合表达载体包括:GST(谷光甘肽-S-转移酶)系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白(MBP)系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。由于翻译起始信号在调控翻译强度中是最重要的,融合表达载体通常SD-AUG间隔已固定,翻译起始信号组织合理,有利于翻译起始,且简化了蛋白分离纯化步骤。将分子质量较小的蛋白质以融合蛋白形式表达,可增强mRNA及表达产物稳定性,并生产出可溶性蛋白。2.1.3利用细胞活性物质载体表达活性蛋白为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解,或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯,经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外,因此要用分泌型载体,表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解,减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施。利用分泌型载体的优点是:①一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定;②一些在胞内无活性的蛋白质分泌后便具有活性,分泌可能使蛋白能够正确折叠;③产生的蛋白质没有氨基酸末端甲硫氨酸,因为切割位点在信号肽与编码序列之间,甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。2.1.4大肠杆菌目的基因共聚体的呈现方式表面表达呈现技术分为两种:一种是噬菌体表面表达呈现技术,另一种是细菌表面表达呈现技术。对于大肠杆菌来说有三种呈现方式:①是将目的基因克隆入外膜蛋白的表面暴露部位的loop区,可将较小的肽呈现到外膜;②是将目的基因克隆入鞭毛或纤毛的结构基因中;③是将目的基因融合到脂蛋白、IgA蛋白酶等的N端或C端。此载体由于表达量低,只适用于一些对蛋白性质方面的研究、筛选文库等。2.2利用新辅助化疗措施改造原有密码子带有相应反密码子(anti-codon)的tRNA将氨基酸引导到mRNA上,进行蛋白质的翻译合成。然而,在不同种类的生物中,各种tRNA的含量是有很大区别的。哺乳动物的细胞中,这些差异还不太明显,但在原核生物中,却由于不同的tRNA含量上的差异很大,产生了对密码子的偏爱性。对应的tRNA丰富或稀少的密码子,分别成为偏爱密码子(biasedcodon)或稀有密码子(rarecondon)。通过统计在E.coli中含量丰富的一些蛋白质中密码子的使用情况,发现AGA、AGG、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和GTC等8种密码子是E.coli中的稀有密码子。如果外源基因含有较多的稀有密码子,其表达效率往往不高。在此情况下,应针对密码子的偏爱性采取措施,如提高转运稀有密码子相应氨基酸的tRNA的浓度或者采用非连续多核苷酸定点突变方法对外源基因中稀有密码子进行同义突变等。时成波等通过改造稀有密码子成功提高了葡萄球菌A(SEA)的表达量。此外,部分学者通过体内和体外两种表达体系表达大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因后发现,在起始密码子后引入使用频率最高的两个第二密码子AAA和AAU可以有效提高翻译效率。增加含有稀有密码子的外源基因表达量的另外一种方法是选用合适的表达宿主菌,如Rosetta(DE3)菌株是BL21(DE3)的一个衍生菌。在该宿主菌中常引入另外一个质粒,它含有编码AGA、AGG等稀有密码子所对应tRNA的基因,从而可以增加tRNA含量,被用来增加含有稀有Arg密码子AGG和AGA,Ile密码子AUA,Leu密码子CUA,Pro密码子CCC和Gly密码子GGA目的蛋白的表达。2.3mrna的降解外源蛋白的mRNA稳定性,也是影响表达效率的一个很重要的条件。Gross等研究发现IFN-β的表达量与mRNA的半衰期成正比例关系。最长的半衰期为4.5min。Wood等在表达β-半乳糖苷酶时发现,诱导表达后,mRNA的合成速度提高了42倍,稳定存在的mRNA量仅提高了4倍。可见,大部分mRNA被迅速降解。mRNA的降解方式有外切和内切,可在5’端和3’端进行。某些mRNA的SD序列上游20多个核苷酸,有一段富含U的区域,易受核酸内切酶的作用,但它对翻译其实是必不可少的。蛋白合成时,核糖体及起始因子的结合,对这一区域起保护作用,避免被核酸内切酶降解。而且,核糖体结合与内切酶作用有相关性,有充足的核糖体时,内切酶的作用机率会减少。mRNA的3’端结构也影响mRNA的稳定性,在E.coli中,约有1000个拷贝的REP(repetitiveextragenicpalindromic)序列存在于染色体上,它在mRNA的3’端出现时,可以避免3’至5’核酸外切酶的作用。2.4最佳诱导温度及诱导材料的确定培养条件包括培养液成分、温度的选择、诱导以及培养时间的长短等等。适用营养丰富的培养液,易于细菌的生长和表达。在大肠杆菌表达系统中,理想的条件是含有适量的Mg2+、K+、NH4+,高浓度的Ca2+和多胺类,以及充足的ATP和GTP可以显著降低蛋白质合成中的错读。温度的影响也很重要,大肠杆菌的最适生长温度为37℃,温度较低对包涵体表达有利,但不适于菌体的生长;而在最适温度下,菌体生长良好,但因能量过多地用于菌体生长,反而对包涵体的表达不利,最佳诱导温度随产物不同而异。一般来说,在25℃至37℃诱导,外源蛋白易于以活性存在,在37℃以上诱导,则易形成包含体。要选择适当的诱导时间来诱导表达,细菌在对数生长期,即OD600=0.6附近时,生长状况良好,易于诱导而合成外源蛋白。提前诱导,菌体太少,外源蛋白产量低;诱导太迟,细菌过老,也不利于基因表达。诱导后的培养时间,随不同的表达载体或启动子而不同。对启动子Ptac和Plac,一般仅需2~3h,PR、PL、Ptrp、Ptrc需时间较长。因此,必须结合外源蛋白的性质及表达载体的特点,选择出恰当的表达条件。另外,表达产物的后加工虽不涉及到外源基因的表达,但是采取适当的方法从包含体得到活性蛋白,可以提高产物的回收率。总之,研究提高外源基因在E.coli中表达效率的工作已进行的十分广泛,被发现的影响表达效率的因素也很多,它们之间有很大的相关性,单单改进其中一个方面往往不能取得明显的效果,有时还存在一定的机遇性。但是,认识到各因素的产生和作用的方式,就能够提出改进表达效率的方法。这方面工作的深入研究有很深远的理论意义和应用价值。3t7rna表达系统的优势pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统,它是最初由Studier等利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统,可以从各种基因(包括原核、真核细胞)生产大量的目的蛋白,pET表达系统的优势主要表现在以下几个方面。3.1t7启动子融合蛋白的检测表达系统的各种启动子及宿主为各类不同蛋白表达产量的最大化提供了重要的选择。另外,几种启动子编码的具亲和力的标签如S.Tag、T7.Tag、His.Tag和HSV.Tag的融合蛋白会很方便后续操作,并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽(融合序列很小),它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒,GST.Tag、S.Tag和T7.Tag序列可用于亲和纯化;His.Tag序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用,尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说,它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行;Nus.Tag、Trx.Tag和GST.Tag序列用来增加其融合伴侣的溶解性。而其它来源的表达系统只能提供少数几种可供选择的克隆和表达体,Novagen能提供较宽的利用T7启动子的策略。因为对于任一个靶蛋白,并没有一个通用的策略或条件,因此这种宽范围的选择是必不可少的。同时pET系统以其独特的优势和载体、宿主之间重组的“协调”而优化特异靶蛋白表达。3.2目的基因的表达pET表达系统能严格控制诱导剂缺失时的基础表达水平,从而阻止低浓度下就能严重影响宿主细胞生长速度的毒性基因的稳定克隆,与其它以E.coli启动子为基础的系统(Lac、Tac、PL)不同的是,由于E.coli的RNA聚合酶不能识别T7启动子,当没有T7RNA聚合酶时,则不存在基础转录,从而使克隆与表达两步很好的分离。目的基因首先用不含有T7RNA聚合酶基因的宿主菌进行克隆,这就避免了对宿主细胞有毒的蛋白产物影响质粒的稳定性。完成克隆后,将其转入染色体上带有lacUV5调控的T7RNA聚合酶基因的表达宿主菌中,用IPTG诱导即可表达目的蛋白。由于T7噬菌体的转录翻译信号非常强,许多难用其他E.coli表达系统表达的基因可在pET系统中高效稳定地克隆和表达。3.3t7基因外源基因表达系统质