大白菜前pancorl合子发育的透射电镜观察

大白菜前pancorl合子发育的透射电镜观察

卡车前（计划财务部m.）是车辆的前科植物。大车前与车前、平车前合称为车前子,为传统中药。有关大车前的研究工作多在化学成分、药理、药性及临床应用等方面(Oshio&Inouye,1982;Todaetal.,1985;Ravnetal.,1990;Miyaseetal.,1991;Tomodaetal.,1991;Nishibeetal.,1995;Samuelsenetal.,1995),而其植物胚胎学方面的研究很少。Johri等(1992)在《被子植物比较胚胎学》一书中对车前科车前属胚胎学特征做过简略的介绍。超微结构研究方面,只见过胚贮藏的蛋白体、卵器和成熟胚囊超微结构研究的报道(Vannereau,1978,1980;Shoar-Ghafari&Vintejoux,2003)。本研究室在光镜水平上对大车前的胚及胚乳发育进行了较为系统的研究(申家恒等,2010)。本研究重点为合子以及原胚发育的超微结构特点,为进一步阐明大车前的生殖结构特征,确立车前科的分类学地位提供依据。1房剥离胚片的制备大车前种植于哈尔滨师范大学植物园内。2007—2009年,每年6月中旬至7月中旬每天上午8:00和下午4:00取材,取花期及花后子房剥离胚珠进行固定。室温下用3%戊二醛(0.2mol·L-1二甲胂酸钠缓冲液配制)固定2~3h,缓冲液冲洗后,再用1%的锇酸(0.1mol·L-1的二钾胂酸钠缓冲液配制)固定4h。缓冲液冲洗后,乙醇系列脱水。Spurr环氧树脂渗透和包埋。LeicaUltracutR型超薄切片机切片,切片厚度70nm,醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色。JEM-1230型透射电镜观察照相。2体细胞衍生细胞大车前胚胎发育类型为柳叶菜型,合子分裂形成顶细胞与基细胞,顶细胞分裂发育成胚体,基细胞只进行横分裂发育成胚柄,基细胞的衍生细胞不参与胚体的构成。2.1粗面质网及细胞器卵细胞受精后形成合子,合子发育最显著特征是细胞壁的构建、体积变化以及极性的加强。发育早期的合子(图1,1、2)具有极性,细胞核位于合点端,核内有异染色质;中部液泡较大,合点端液泡较小,合点端的细胞壁尚未形成,与中央细胞之间的质膜间隙大小不一,有的形成较大空隙,有的两质膜紧密贴合;细胞质主要集中核周区,大量线粒体内嵴明显;质体形态多样,不含淀粉粒;粗面内质网呈短管状;液泡为自体吞噬泡,内含有电子致密物质;没有发现高尔基体。合子发育中期体积缩小,细胞核位于近合点端,核仁增大有液泡,核内分布异染色质,小液泡较少,其内含电子浓密物质(图1,3),细胞质浓密,分散着大量线粒体、质体与粗面内质网。珠孔端的细胞壁明显,合点端的质膜附近有高尔基体分布,活跃的分泌小泡,参与细胞壁的建成(图1,4),最初形成的合点端细胞壁呈蜂窝状,随后蜂窝状的细胞壁逐渐连接形成完整的细胞壁,将合子包围(图1,3、5)。随后,合子体积伸长,细胞质里出现较多的小液泡(图1,5)。细胞核位于近合点端,细胞核大,核仁明显、存在核液泡;细胞器绕核分布,质体形态多样,富含淀粉粒;线粒体多为圆球形,内嵴明显;内质网、高尔基体数量增多(图1,6、7)。合子极性加强(图1,5)。合子分裂前期,合子纵向延伸,体积达到最大。小液泡融合成大液泡位于珠孔端,细胞核位于合点端(图1,8)。细胞壁完整,珠孔端的壁略厚于合点端。细胞质中细胞器的含量明显增多,分布于细胞核及液泡的周围,最显著的是质体,不但数量多,而且含淀粉粒(图1,9)。表明合子分裂前期其代谢活动活跃。2.2原生动物发育的超微结构特征2.2.1顶细胞细胞间的胞间连丝胚的发育是从合子分裂开始,历经原胚期、心形胚、鱼雷胚与子叶胚,最后达到种子成熟。本研究主要集中于原胚阶段超微结构特征,人为划分4个阶段,即二细胞原胚时期、小球胚时期、中球胚时期和大球胚时期。合子的极性决定了合子分裂方向以及胞质分割不均等。合子的横分裂使基细胞体积明显大于顶细胞,胞质集中在顶细胞内,顶细胞比基细胞的电子密度高(图1,10)。顶细胞与基细胞间的细胞壁上存在胞间连丝(图1,11),细胞之间存在大量的质膜内陷(图1,12)。二细胞之间的差异预示顶细胞将发育为胚体,而基细胞将发育为胚柄。顶细胞细胞质中的核糖体数量增加,导致其电子密度提高(图1,10),细胞核、核仁大且明显,核仁内有一大的核液泡,核膜不规则且不清晰。线粒体数量多,内嵴显著;质体数量较少;核膜周围分布一些管状内质网以及一些小液泡,液泡膜不清晰,液泡内含有电子密度高的物质(图2,1)。基细胞细胞质中核糖体数量较少,导致其电子密度降低,细胞核与核仁大,核膜规则,核仁内含有液泡,核内存在异染色质。线粒体内嵴明显,部分线粒体外膜不清晰;管状内质网分布于细胞质里;高尔基体大量分布,旺盛分泌小泡(图2,2、3);基细胞珠孔端存在许多小液泡(图2,2)。顶细胞与基细胞间的细胞壁上存在胞间连丝(图1,11),并存在大量的质膜内陷,其内有分泌小泡的存在(图1,12)。二细胞原胚与周围的胚乳细胞交界处分布着染色深的黑色嗜锇颗粒(图1,10;图2,4)。二细胞原胚发育后期,基细胞和顶细胞的液泡进一步融合、扩大,致使原胚体积纵向延伸(图2,4)。2.2.2胚柄细胞形态和内部质网特征胚体从8细胞向16细胞胚体发育,胚柄为单列4个细胞。胚体细胞的分裂速度快于胚柄(图2,5)。由于胚体细胞分裂速度快,胚体细胞体积变化不明显(图2,6),胚体细胞细胞质电子密度高,细胞核大,染色质较深,核膜规则且清晰,核内含大且不规则的核仁,核仁内有多个小核液泡(图2,5、6)。线粒体、质体沿核周围分布,线粒体呈圆球形或棒形,内嵴明显;质体形态多样,其内不含淀粉粒。内质网、高尔基体、分泌小液泡分布于沿壁的细胞质内(图2,7~9)。各细胞间的质膜内陷内含分泌小泡(图2,8)。小球胚的胚柄细胞数大约4~8个(图2,5)。胚柄细胞数的增加将胚体推入胚乳本体之中(图2,5)。胚柄细胞核较大,核膜清晰,核内存在1或2个核仁且具核液泡(图2,5)。核周围分布大量的线粒体和质体,质体不含淀粉粒。内质网呈管状散乱分布,数量少。少量的高尔基体在细胞相接的细胞壁附近出现(图3,4、8)。此时为小球胚的形成期,其营养物质主要来自合子贮存以及胚柄吸收并转运的营养物质。2.2.3含淀粉粒的分离和鉴定小球体进一步发育形成中球胚(图2,10;图3,1)。胚体细胞分裂速度加快,细胞数量迅速增加、小液泡汇聚,融合成稍大的液泡,细胞核较小,核仁清晰,有小核仁,异染色质和核液泡存在(图2,10)。细胞器的种类与数量没有太大变化,质体大量分布,形态多样,内含淀粉粒;线粒体广泛分布,内嵴明显;高尔基体大量存在,旺盛分泌小泡,主要分布于细胞壁附近(图3,7)。细胞间有质膜内陷,并有分泌泡存在。胚体周围可见退化的胚乳细胞(图3,1)。胚体周围存在嗜锇颗粒(图3,7)。胚柄细胞达到8~16个(图3,1、2)。细胞数不再增加,胚柄最为发达。合点端的胚柄细胞的细胞质浓厚,细胞器的种类与数量与小球胚期并无太大变化。胚柄珠孔端的细胞最大,大液泡占据大部分体积,细胞质和细胞核被挤向合点端,细胞壁厚,质膜内陷,分泌泡多。细胞质里存在颗粒较大的嗜锇颗粒(图3,1、2;图2,10),可能与胚柄通过顶端细胞从珠被组织中吸收营养物质有关。胚柄细胞之间的壁上也存在质膜内陷,有分泌小泡,并有少量胞间连丝存在(图3,5;图4,2),胚柄细胞质里有丰富的细胞器(图3,6)。胚体所需营养主要依赖胚柄自珠被组织吸收并转运至胚体,供胚体发育。2.2.4体外细胞的诱导退化胚体细胞继续分裂,不断增加胚体细胞数量。胚体细胞核仁明显,含有核液泡并有异染色质(图4,1、7、8)。细胞质中含有大量线粒体、不含淀粉粒的质体、内质网、大量杯状高尔基体和分泌小泡(图4,3~6)。胚体外层细胞均存在质膜内陷(图4,4、5)。胚体周围的胚乳细胞解体,细胞降解后的物质凝成电子致密、大小不等的嗜锇颗粒贴壁分布(图4,7、8),大球胚后期,胚乳细胞进一步解体,胚体周围出现含水解物的腔(图4,7)。胚柄珠孔端细胞先行退化,而后合点端细胞开始退化(图4,8、9)。细胞器的退化依然按质体先解体,其后依次为线粒体、高尔基体和液泡(图3,4、9)。胚柄细胞间有质膜内陷(图3,4),细胞壁与质膜之间以及胚柄细胞间存在一层浓密均匀的物质(图3,9)。随着大球胚出现器官分化,胚柄彻底退化,丧失其功能,只能看到胚柄痕迹。3讨论3.1大地构造的早期合子型合子的特征合子为卵细胞与精子融合的产物,是新一代孢子体的第一个细胞。概括许多作者有关合子超微结构特征的观察结果,合子有3个主要特点,其一为体积的变化,其二是合点端细胞壁的修复,其三是极性的加强。这些变化均为合子分裂以及子细胞的分化奠定基础。大车前合子的超微结构的特征基本符合上述特点。但是需要指出在不同植物里均存在或长或短的“合子静止期”(Hu,2005)。超微结构研究表明在此时期合子经历细胞质重组过程,大车前合子形成初期合子核位于合点端,分布于细胞核周围的细胞器中线粒体、质体数量较多,质体内不含淀粉粒;而合子后期,围绕在核周围的各种细胞器的数量增加,而且质体内有明显的淀粉粒积累。合子极性的加强,预示将决定其分裂方向,质体内淀粉粒的积累将为分裂活动提供能量物质。3.2原胚及球胚期营养主要依赖合子和原胚的贮藏原胚发育的不同阶段,营养物质的来源有所不同。推测大车前原胚发育营养物质来源如下。卵细胞受精致使围绕卵核周围的质体内的淀粉被消耗;合子前期,核周围的质体内无淀粉粒,经历合子静止期自孢子体吸收营养物质,合子后期质体内重新积累淀粉粒。这在以前的研究中没有引起重视。以往的研究认为,合子及原胚早期发育所需营养主要依赖卵细胞本身贮藏的营养物质(胡适宜,1964;You&Jensen,1985;张松林和金芝兰,1994)。本研究结果表明二细胞原胚以及四细胞原胚之前的胚细胞内均可见质体中存在淀粉粒。因此,可以推测,原胚发育初期所需营养主要依赖合子贮藏的淀粉而不是卵细胞贮藏的营养物质。这种情况与刺五加(刘林德等,1998)类似。球胚期,胚柄最为发达,不但将胚体推向胚乳本体之中,同时与孢子体相连,吸收并传输来自珠被组织的营养物质,供胚体细胞迅速增殖。球胚后期,胚柄开始退化,胚体周围的胚乳细胞被消化水解,并浸在胚乳水解液的空腔里,推测胚体表层细胞吸收胚乳水解的营养物质供胚体进一步发育。3.3质膜内陷的存在机制在大车前胚胎发育过程中,质膜内陷大量存在。在胚柄细胞间、胚体细胞间以及胚柄、胚体与胚乳细胞相连的细胞之间很少出现胞间连丝,但均存在质膜内陷。质膜内陷的细胞的细胞质内存在较丰富的内质网、高尔基体及其分泌小泡,质膜外方的质膜内陷处存在许多小泡物,质膜与细胞壁之间也存在大量的小囊泡结构。质膜内陷的形成与高尔基体产生的分泌小泡外排可能直接相关,推测通过此过程将细胞器合成的糖类、酶类外输,参与细胞壁的构建以及细胞间的物质交换;质膜内陷的存在,扩大了质膜的表面积,从而增加分泌与吸收营养物质的效率。由此认为,质膜内陷可以作为细胞代谢活跃的形态学标志之一。3.4乌氏体及花粉粒周围嗜颗粒郭洁等(1989)在甜叶菊的绒毡层细胞内,胡适宜等(1992)在春兰花药的药壁表皮细胞内,姚雅琴和杨天章(1996)在小麦花药的药室内壁细胞、药室表皮细胞、绒毡层附近、乌氏体和花粉