耐盐酵母对酱油风味的影响

耐盐酵母对酱油风味的影响

柴油的味道是“色、香、味、体”的综合体现，即汽油的颜色、香气、味道和体。其中，香味是决定油田味道的重要因素。在酱油的高盐稀态发酵过程中,一般都要添加耐盐产香酵母,从而改善酱油的风味提高酱油质量。较常见的耐盐产香酵母菌有S酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)、T酵母菌(Torulopsisversatilis)和C酵母菌(Candidaetchellsii)。目前酱油中已检出的风味成分近300种。酱油的风味物质按包含醇类、酯类、酸类、醛类及缩醛类、酚类、呋喃酮类和含硫化合物等。某些风味成分形成途径已被了解,还有一些风味成分形成途径尚待继续研究。风味成分的组成与原料品种、原料配比、菌种、生产工艺及技术管理等有关。了解酱油风味物质的种类及其产生的机制对于如何改造耐盐酵母从而改善酱油风味提高酱油质量至关重要。1油食品的类型和形成机制1.1盐水发酵过程中t酵母代谢产物的合成酱油风味成分中含量最多的是醇类,并以乙醇为主。乙醇是由S酵母和糖类共同作用产生的,广泛存在于整个发酵过程中。糖在S酵母的作用下形成乙醇,但是因为酱油高盐稀态发酵后期的盐水发酵中盐的浓度很高,导致由S酵母发酵产生乙醇的糖类物质种类受到限制。在盐水发酵过程中,S酵母只能利用葡萄糖却不能利用麦芽糖。如果在无盐的条件下,S酵母就能利用麦芽糖。与S酵母不同,在盐水发酵过程中T酵母能够利用麦芽糖。在乙醇发酵过程中最关键的酶是由ADH1基因编码的乙醇脱氢酶。酱油中的高级醇主要有丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇等。S酵母和酿酒酵母醇类表现出相似的合成途径。高级醇的产生直接与氨基酸代谢相关,即氨基酸脱氨基、脱羧基后生成少一个碳原子的醇类。高级醇可以通过埃尔利希(Ehrlich)途径由相关的支链氨基酸产生,这包括一个转氨反应产生相应的α-酮酸,一个去羧基反应产生相应的醛,然后醛发生还原反应产生醇类。此外,α-酮酸作为关键的中间产物,也可在各自的氨基酸合成途径中直接合成,并直接转化成高级醇。在线粒体和细胞质中分别由BAT1和BAT2基因编码的氨基转移酶是催化支链氨基酸代谢的关键酶。当然在S酵母中,高级醇类可能还存在其他的合成途径。向S酵母中加入支链的氨基酸导致相应的醇类产量增加。此外,酱油中的苯乙醇是具有玫瑰香气的化合物,它是由T酵母在发酵过程中经降解,再还原或经碳水化合物代谢和氨基酸的生物合成过程这2种途径而生成。1.2发酵时酯类物质的变化酯类是构成酱油风味成分的主体,一个酸元和一个醇元即可生成酯。酯类作为基本的香味物质,可使麦芽酚、苯乙醇等关键风味化合物的气味更醇厚,缓冲酱油中盐分的咸味。酱油中的酯类有多种,由于发酵过程中形成的酸类和醇类是多种多样的,故生成的酯也是多种多样的。目前,已经确认酱油中含乙酸乙酯和乳酸乙酯等45种酯类。酱油中高沸点酯类含量较多,而低沸点酯类含量则较少。由ATF1和ATF2基因编码的乙醇酰基转移酶催化的乙酰辅酶A和高级醇发生还原反应产生挥发性酯类。除此外,由EHT1和EEB1基因编码的其他酶类对乙酸乙酯的生成也很重要。1.3碳糖发酵生成乳酸和乙酸酱油风味成分中的有机酸以乳酸和乙酸为主,乳酸菌利用葡萄糖进行乳酸发酵生成乳酸,某些乳酸菌还可利用五碳糖(阿拉伯糖、木糖)发酵生成乳酸和乙酸。其中,乙酸是由乙醇氧化而成。除此之外,酱油中还含有柠檬酸、琥珀酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸等有机酸。酱油中的有机酸类互相起协同效应,丰富了酱油的风味。它们和酱油中的醇类在贮存或烹调过程中起酯化反应,会提高酱油的酯香味,同时有机酸的酸味也可以缓和咸味。1.4醛的调剂作用酱油中的醛类物质有甲醛、乙醛、丙醛、异丁醛、异戊醛、酚醛等。其中代表物质是乙醛,呈辛辣刺激性气味。醛除一部分由发酵产生的以外,大部分是由氨基酸脱胺、脱羰基生成。微量的醛在酱油香气中起到调和作用。加热酱油会提高其中乙醛和一些小分子醛类的浓度,而这些醛类化合物一般可与醇类、甲硫醇等发生缩合反应,产生与本身不同的香气,使酱油风味更复杂化。1.5乙基愈创苯酚酱油中的酚类物质以挥发性酚为主体,特别是烷基苯酚,其是由来自小麦的原料经米曲霉作用后再经T酵母或C酵母发酵生成的。其代表性成分是4-乙基愈创木酚(4-EG)和4-乙基愈创苯酚(4-EP)。其香气特点十分明显、活性强,为酱油带来类似丁香和烟熏的香味,是酱油的一种主要的香气成分。4-EG是酱油风味中有代表性的化合物之一,口感有发酵酱油特有的滋味,同时它还具有调节酱油中咸味的作用,增加了酱油的圆润感。酱油中含有1mgL~2mg/L的4-EG就可以明显提高酱油的风味。4-EG和4-EP分别来源于4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸。而4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸则来源于酱油生产中的麸皮中。这个转变过程涉及到脱氨基作用,这也是S酵母无法作到的。1.6化合物类物质及理化性质除了上述特征风味物质外,酱油中还存在着如4-羟基-2(或5)乙基-5(或2)-甲基-3(2氢)-呋喃酮(HEMF)、4-羟基-2,5–二乙基-3(2氢)-呋喃酮(HDMF)、4-羟基-5甲基-3(2氢)-呋喃酮(HMMF)等呋喃酮类物质;2,3-二乙基-2-戊烯、苯乙烯等烯类物质;四氢化萘、甲基萘等萘类物质以及部分有机酸盐类。其中,HEMF是一种与酱油关系最密切的香气成分,它具有小甜饼干那样类似焦糖的香气。在酱油中HEMF的含量越多越好,它能代表酱油的主体香气。同时,HEM具有抑制食道癌的作用。目前对HEMF形成机制的研究比较多。五磷酸循环对HEMF的形成至关重要。含有7个碳的HEMF是由含5个碳的氨基化合物与由葡萄糖代谢产生的含2个碳的化合物发生反应产生的。HEMF形成的速率和数量受酵母菌种类、发酵液中葡萄糖和氯化钠浓度的影响。2盐酵母的改造由酱油风味物质的种类和形成机制可知,对耐盐酵母进行改造是改善酱油风味的关键。对酵母菌株改造的遗传操作策略主要包括随机诱变、有性重组、代谢工程、进化工程和基因组重排等。2.1可诱变的酱油品质菌株的筛选利用诱变剂处理耐盐酵母菌是改善酱油风味的最经典方法。常用的诱变剂有亚硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)、甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate,EMS)等。通过诱变的方法可以筛选得到酱油风味明显改善的菌株。如AOKIT等筛选得到的突变菌株产生的2–苯乙醇是野生型菌株的38倍。2.2菌株的杂交试验改造酵母菌的首要方法就是将不同基因背景的菌株进行杂交。KIMJK将S酵母菌和T酵母菌进行杂交得到的重组菌株使酱油的风味得到了明显改善,同时缩短了发酵周期。2.3代谢途径修饰代谢工程是在对代谢流量及其控制进行定量分析的基础上进行代谢途径改造,以最大限度的提高目的代谢产物。从广义上来讲,利用分子生物学方法对某一代谢途径进行修饰也属于代谢工程的范畴。目前,已经构建了多个S酵母/大肠杆菌的单拷贝和多拷贝的穿梭质粒(如pZEU、pZEL和pZEA),其选择标记分别为ScURA3、ZrLEU2和ZrADE2。利用这些质粒可以过量表达某一风味物质形成过程中的关键蛋白,从而改善酱油风味,满足人们对酱油不同风味的需求。2.4altranscraptionmortgage模型进化工程就是在达尔文进化理论基础上进行随机突变与选择的一种技术方法,也称为定向进化。其中,整体转录系统工程(globaltranscriptionmachineryengineering,gTME)就属于进化工程的范畴。gTME是通过易错PCR突变来改变用于调解基因整体转录的关键蛋白,并因此使相关基因达到一个新的转录水平。gTME已经成功应用到原核生物和酿酒酵母中。确定S酵母、T酵母和C酵母的全局转录因子序列是gTME策略能否改善酱油风味的必要条件。2.5微生物群体重组承担技术基因组重排就是在多个母本杂交基础上把DNA改组与传统的育种方法有机结合起来的技术方法。将经典的育种和DNA改组相结合的基因组重排技术为快速的使微生物群体产生复杂后