门静脉高压症时细菌移位与内毒素血症和一氧化氮的关系

门静脉高压症时细菌移位与内毒素血症和一氧化氮的关系

通过研究大鼠肝前门静脉高压的动物模型，在门静脉高压下研究了细菌位移、内毒素血症和一氧化氮（no）之间的关系。材料和方法一、实验材料1.实验动物采用本院动物中心提供的SD大鼠,体重250~300g。2.主要试剂和机器硝酸镧、巧克力麦康凯琼脂、左旋精氨酸、单-甲基精氨酸(Sigma,USA)。压力转换器和透射电子显微镜。二、模型4:将左外投射克氏原螯虾a/d采用门静脉部分缩窄(PVS)的方法建立门静脉高压的动物模型。将大鼠随机分为4组,每组10只。A组:行假手术,为对照组。除不结扎门静脉外,其他操作与模型组相同。皮下注射生理盐水1ml,1次/d,连续14d;B组:行PVS,皮下注射与A组相同;C组:行PVS,皮下注射1ml左旋精氨酸300mg/kg,1次/d,连续14d;D组:行PVS,皮下注射1ml单-甲基精氨酸50mg/kg,1次/d,连续14d。三、肠之分段与培养术后第14天,在氨基甲酸乙酯(6mg/kg)的麻醉下,无菌操作取肠系膜淋巴结和脾,称重,放入无菌的匀浆器中。测定门静脉压力后从下腔静脉采血,最后取末段回肠约1cm,放入漂洗液中。四、观察指标和方法1.通过观察腹部和身体的变化观察胃肠道瘀血程度,门体侧支循环形成的情况。2.门静脉压测量连接塑料管的4号半静脉针,充以灭菌肝素盐水。穿刺门静脉,从多导记录仪上读取数据,以cm?H2O表示。3.培养菌株的制备在放入淋巴结和等重量脾的匀浆器中加入0.5ml无菌的液体培养基,匀浆,取上清放入巧克力麦康凯培养基中,于37℃培养48h。另取1ml血放入血培养瓶中,37℃培养48h,而后行菌落计数和菌种鉴别。4.血液中毒素的测定采用偶氮显色鲎试验方法测定内毒素水平。5.血液中的no2-试验采用微量比色法。6.透射电镜观察将末段回肠标本在含0.1mmol/L二甲砷酸钠和2%戊二醛中切成1mm3的小块,放入含镧的固定液中浸泡、固定、脱水、包埋,超薄切片不染色,透射电镜下观察。7.统计评估用方差分析或χ2检验及多因素相关分析判定变量之间的关系。结果一、腹部和腹部变化的肉眼观察PVS各组(B、C和D组)有胃肠道瘀血,肠系膜静脉扩张,侧支循环形成,脾增大,A组则正常。二、门静脉压力术后第14天,PVS各组门静脉压力均较A组高,A组为(3.68±0.21)cm?H2O、B组为(5.92±0.18)cm?H2O、C组为(7.05±0.32)cm?H2O、D组为(4.22±0.29)cm?H2O,P值均<0.01,D组较B组的门静脉压力低(P<0.05)。三、革兰阴性细菌、分离和感染对pvs检出率的影响PVS各组肠系膜淋巴结的细菌检出率均高于A组(A组:20%;B组:76%;C组:69%;D组:71%,P值均<0.01),PVS各组间检出率差异无显著意义(P值均>0.05)。脾和血液培养均为阴性。对检出的细菌进行菌种鉴定,均为革兰阴性细菌。菌种和所占比例为:A组:大肠杆菌占70%、变形杆菌占30%;PVS各组:大肠杆菌占33%、肠球菌占15%、变形杆菌占12%、克雷氏菌占20%、假单胞菌占10%。四、组eu/ml,p值比较PVS各组的血内毒素值均比A组高,A组:(0.28±0.08)EU/ml;B组:(0.54±0.08)EU/ml;C组:(0.55±0.06)EU/ml;D组:(0.48±0.07)EU/ml,P值均<0.01。PVS各组之间差异无显著意义(P值均>0.05)。五、c组与b组PVS各组血NO2-值均显著高于A组,A组:(5.12±0.29)μmol/L;B组:(9.23±0.19)μmol/L;C组:(10.33±0.27)μmol/L;D组:(7.51±0.18)μmol/L,P值均<0.01,C组与B组之间差异无显著意义(P>0.05)。D组较B组低(P<0.01)。六、血no2-水平细菌移位率、血内毒素和门静脉压力与血NO2-水平呈显著正相关(r值分别为0.6033、0.6526和0.7251,P值均<0.05)。七、间质细胞的分布PVS各组肠粘膜上皮细胞的微绒毛变得短而稀疏,可见电子致密度高的镧颗粒沉积在肠粘膜上皮细胞及下面固有层的间质细胞间,呈线条状分布,线条的粗细不尽相等,呈弯曲或缠绕成不规则圈网状;在间质细胞的各种连结处也可见镧颗粒沉淀;也可见镧颗粒沿着肠粘膜上皮细胞间分布,见图1~6。A组则未发现上述变化。门静脉高压可引起细菌位移和内毒素血近年来,肠道细菌移位引起的肠源性感染作为重要的病理现象得到了广泛的关注。Berg等将细菌移位定义为细菌通过肠粘膜上皮进入固有层然后到肠系膜淋巴结和其他器官。Alexander等进一步提出肠道微生物和细菌产物,如内毒素,都可通过肠粘膜屏障。本研究中肠系膜淋巴结的细菌移位率明显升高,血中内毒素水平也显著增加,而脾和血中未检出细菌,说明在门静脉高压状态下的肠道改变可引起细菌移位和内毒素血症。对照组也有一定程度的细菌移位,可能与手术应激有关。肠道粘膜是防止细菌移位和内毒素血症的主要屏障。目前认为各种理化因素和病理原因造成肠粘膜通透性增强和结构破坏可能是导致发生移位的基本原因。本研究发现门静脉高压可引起肠粘膜屏障的通透性增高。作为示踪剂的镧直径为4nm,在正常情况下不能进入细胞;当细胞膜通透性改变后,即细胞孔径增大后才能进入细胞。文献报道,肠上皮细胞通过刷状缘的微绒毛吸收或吞噬物质后,通过其底部或与其他细胞的连结处排出,进入固有层细胞,进一步进入微静脉或小淋巴管。本研究中镧侵入门静脉高压组的固有层,说明屏障通透性已增高。粘膜上皮细胞的微绒毛呈明显受损的改变,这种改变可能是通透性增强所导致的,使粘膜细胞对外源性抗原的阻碍力下降,使细菌和内毒素易于穿过肠粘膜屏障。本研究结果显