络气虚滞型血管内皮功能障碍病证结合动物模型的建立及通络方药的干预作用

络气虚滞型血管内皮功能障碍病证结合动物模型的建立及通络方药的干预作用

中医认为，血液在血管中的运行需要向下运动。气虚血虚不能锻炼或气虚血瘀不能导致血液运动障碍和血管病变。络气虚滞(stagnancyofcollateral-Qiinadeficiencycondition,SCQDC)是脉络病变由功能性病变向器质性病变发展的早期阶段,与血管内皮功能障碍具有内在一致性,这对于血管病变防治的基础研究具有重要的指导意义。然而此方面的研究刚刚起步,尚缺乏公认的动物模型。本研究以络病学理论为指导,基于400例血管内皮功能障碍患者原始资料数据分析建立的“脉络-血管系统病”络气虚滞血管内皮功能障碍诊断标准,以Wistar大鼠为实验动物,采用高同型半胱氨酸血症诱发血管内皮功能障碍为基础病理模型,叠加“基础进食+强迫负重游泳”诱发气虚证候,制作络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型,以络气虚滞型血管内皮功能障碍证候诊断标准为依据,分别从一般状况、血管内皮功能变化等方面对所建动物模型进行综合评价,同时应用单味益气中药人参、益气活血的双参(人参+丹参)、通络复方通心络(人参、水蛭、全蝎、赤芍等)三种通络方药进行干预,以期为该方面的研究提供相应的实验平台。1免疫组织化学游泳缸(100cm×70cm×80cm);LEICARM2125切片机(中国上海Leica公司),BL-420E+生物信号采集系统(成都泰盟科技有限公司),YH-4型张力换能器(北京航天医学工程研究所);SP免疫组化检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司),抗ACE抗体(美国Santacruz公司),抗AT1、ET-1抗体(武汉博士德生物有限公司),抗eNOS抗体(北京中山金桥生物有限公司),氯化乙酰胆碱、苯肾上腺素(Sigma公司);蛋氨酸(河北省农科院提供,由河北省实验动物中心制作成3%的高蛋氨酸饲料,纯度99.9%,批号B7NE-05-0007-MC02),人参注射液、双参注射液(由石家庄以岭药业股份有限公司提供),通心络超微粉(由石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号20050530)。2实验方法2.1实验动物及动物健康雄性Wistar大鼠180只,体质量220~250g,购于北京维通利华实验动物中心,许可证号SCXK2002-0003。随机分为对照组、同型半胱氨酸(HCY)组、络气虚滞组、人参组、双参组、通心络组,每组30只。2.2静态被放入量HCY组喂饲3%高蛋氨酸饲料(不限食),不限饮水。络气虚滞组于喂饲高蛋氨酸饲料4周后,于基础进食(每只成年大鼠于静息状态下的采食量,约相当于自身体质量的5%)条件下力竭游泳。每只造模大鼠在25~27℃水温的自制游泳缸中,每日强迫负重(按每只造模大鼠自身体质量的5%计算)游泳,采取2次游泳法,前后相差10min,游泳至力竭为止,以最大限度耗竭动物体力(力竭标准:游泳范围逐渐缩小,动作明显失调、慌张,鼻部在水面上下浮动,头部没入水面下10s不能上浮)连续游泳训练14d。2.3通心络组内灌胃给药方法人参注射液组、双参注射液组于喂饲高蛋氨酸饲料开始,即分别给予1ml/100g体质量腹腔注射;通心络组按1ml/100g体质量灌胃给药;对照组和HCY组给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃,于每天上午9~10点进行,每周给药6次,周日休息。3测试指标和方法3.1一般情况下的监控每日观察各组大鼠的一般情况(皮毛、鼻色、尾色、大便等)。记录络气虚滞组大鼠的力竭游泳时间;每3d记录动物体质量一次。3.2小鼠肉的急性毒性试验,记录在肌肉疲劳于末次给药30min后,将每只大鼠(HCY组除外)放在自制爬杆架上,使其肌肉处于静力紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳时从爬杆架上跌落的时间,第3次跌落时终止实验,累计记录3次跌落时间为爬杆时间。3.3对血管内外功能的生物化学指标的检测3.3.1edta-na230l和抑肽酶20l的抗凝活性测定各组大鼠于造模结束后,禁食7h,10%水合氯醛麻醉下颈动脉插管采集血液标本5ml,其中2ml注入含有10%的EDTA-Na230μl和抑肽酶40μl的无菌抗凝试管中(冰浴中保存),混匀,4℃,3000r/min,离心10min,分离血浆备检;另外3ml注入含有消炎痛-EDTA-Na2液0.2ml的无菌抗凝试管中(冰浴中保存),4℃,3500r/min,离心15min,分离血浆备检;同法采取2ml血液,分离血清备检。3.3.2u3000血管环拉合各组于末次给药后30min,随机取出3只大鼠,断头处死,迅速分离胸主动脉,冰盐水冲净残留的血液,并迅速放入盛有冷Krebs液的蜡盘中,并持续通入95%O2与5%CO2的混合气体,并将血管修切成3~4mm宽的2个主动脉环,分离后用2个不锈钢针轻轻穿过血管环,垂直悬挂于盛有10mlKrebs液的浴槽中,一端固定于浴槽底部,另一端连接张力传感器,与BL-420E+生物信号采集系统相连。温度保持在37℃左右,并持续通入上述混合气体。在30min内将血管环拉置满张力2g,在2g基础张力下平衡1h,期间每隔15min换液1次。加入10-3mol/L苯肾上腺素(PE),待收缩反应曲线至平台期,利用Krebs液冲洗3次,使其回落至基础张力,确认其反应性稳定后,开始实验。再次重新加入10-3mol/L苯肾上腺素,待收缩反应曲线至平台期,再加入10-3mol/L乙酰胆碱(ACh),观察对ACh的舒张反应变化,记录反应曲线,结果以对ACh舒张值占PE最大收缩值的百分比表示。血管环舒张率(%)=PE收缩峰值−ACh舒张峰值PE收缩峰值−基础张力值×100％ΡE收缩峰值-ACh舒张峰值ΡE收缩峰值-基础张力值×100％3.3.3在各组大鼠动脉组织中，奥登斯塔、at1和enos的发现用免疫组化的方法检测。4统计分析方法所有数据用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。采用SPSS11.5统计软件包,多个样本均数比较用单因素方差分析(One-WayANOVA),多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(leastsignificantdifference,LSD),若方差不齐则采用Satterthwaite-t’检验行两两比较,以P<0.05作为判定差异显著性的标准。5结果5.1组动物体质量比较络气虚滞组自施加力竭游泳因素后的第13天,游泳时间最长,此后则呈现明显的下降趋势。与对照组比较,络气虚滞组动物体质量显著下降,且出现明显的精神萎靡,眼睑下垂,反应不灵敏;皮肤松弛,皮下少有脂肪,甚至抓之触骨,背部毛发少光泽,出现缩肩拱背;尾、鼻淡红;大便软有形。各治疗组一般情况略有改善。另外,与络气虚滞组比较,通心络组大鼠爬杆时间明显延长(P<0.05)。5.2组大鼠血清hcy、络透气性、背景的比较结果见表1。与对照组比较△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与HCY组比较▲P<0.05;与络气虚滞组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与对照组比较*P<0.05,***P<0.001;与络气虚滞组比较#P<0.05,##P<0.01;与人参组比较▲▲P<0.015.3各组大鼠胸动脉疾病的内在依赖率为ach结果见表2。5.4各组大鼠、et-1、at1和enos免疫组的化学结果的比较结果见表3。6血管内皮损伤对络气虚滞血管内皮功能障碍患者调查的研究资料显示,该类患者一方面内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)等血管活性物质分泌失常,肱动脉介导的内皮依赖性舒张功能(FMD)下降;另一方面表现出乏力、神疲、气短、懒言、脉弱等征象。据此,本研究选用健康成年Wistar大鼠,以高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症致血管内皮功能障碍为病理损伤模型,根据《素问·刺志》的“谷盛气盛,谷虚气虚”,《灵枢·五味篇》的“谷不入半日则气衰,一日则气少矣”;《素问·举痛论》的“劳则喘息汗出,外出皆越,故气耗矣”。采用叠加基础进食复合强迫负重游泳诱发气虚证候的方法,建立络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型。结果显示,模型大鼠出现了精神萎靡,眼睑下垂,反应迟钝,毛发枯槁,体质量显著下降,皮下少有脂肪,甚至抓之触骨,鼻尾颜色苍白,大便不成形或稀溏等现象。与络气虚滞血管内皮功能障碍患者的证候特征基本吻合。另外,络气虚滞组大鼠耐力降低,力竭游泳时间呈现非线性波动,波动的幅度逐渐减小且呈现下降趋势,与程志清等的研究结果一致。从另外一个角度佐证了络气虚滞大鼠的证候学表现与临床患者证候表现的一致性。ET-1是目前已知缩血管作用最强的血管活性物质之一,通常以极低的生理浓度存在于体内,但在血管内皮损伤的情况下,ET-1的合成、释放增加可达数倍或数10倍。同时在ET-1和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)之间还存在着相互增强作用。本研究结果显示,与对照组比较,HCY组大鼠血浆中AngⅡ水平明显升高(P<0.01),络气虚滞组血浆AngⅡ、ET-1水平亦显著增高(P<0.001,P<0.05),且AngⅡ含量显著高于HCY组(P<0.05)。提示本实验所建模型可能存在有两者之间的协同作用,从而使得血管内皮的损伤进一步加剧。血栓素A2(TXA2)是活性很高的血小板致凝剂,并具有强烈收缩血管平滑肌的作用。前列环素I2(PGI2)的生理作用与TXA2相拮抗,可使血小板聚集,舒张血管平滑肌,维持血管内皮的完整性,表明血管内皮结构完整和功能的正常与PGI2/TXA2平衡的维持关系密切。本研究结果显示,络气虚滞组TXA2含量较对照组进一步显著升高(P<0.001),而PGI2含量则近一步下降(P<0.01),同时作为经典的内皮依赖性舒张因子NO水平与PGI2的变化趋势一致,这与络气虚滞血管内皮功能障碍患者的临床研究结果相一致。上述结果提示,在HCY致血管内皮损伤的反应中已经有ET-1、TXA2、PGI2、NO等血管活性物质分泌的异常,而气虚证候的存在可从某种程度上进一步加重缩血管与舒血管活性物质之间的平衡紊乱,另外,本实验结果还显示,络气虚滞大鼠动脉组织eNOS阳性信号较对照组和HCY组明显减弱,ACE、AT1、ET-1阳性信号明显增强,进一步从关键酶和受体水平为上述推测提供了佐证。另外,本实验利用体外血管环技术对各组胸主动脉血管对ACh的内皮依赖性舒张反应进行了检测,结果显示,络气虚滞组血管内皮依赖性舒张反应显著弱于对照组(P<0.05,P<0.001),提示所建动物模型在血管内皮依赖性舒张反应方面与临床患者具有一定的一致性。本实验给予三种通络方药干预后,动物的一般情况出现了不同程度的改善,人参、双参可显著降低血浆中AngⅡ、ET-1水平,升高NO含量。通心络除了显著降低血浆AngⅡ、ET-1水平,升高NO含量外,还可使血浆中TXA2、PGI2水平分别呈现出下降和上升趋势。同时三种通络方药还可从不同程度上减弱ACE、AT1、ET-1阳性信号,增强eNOS阳性信号表达,此作用以通心络组最显著。提示成分明确的单味益气中药可在一定程度上改善血管内皮功能,并提示此时血管病变正处于功能性病变阶段;另一方面提示通络复方在改善血管内皮功能方面在一定程度上优于单味中药。综上所述,本研究以络气虚滞血管内皮功能障碍患者的临床研究资料为背景,结合“饥则损气”、“劳则气耗”的中医病机理论,首先以高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症致血管内皮功能障碍为病理基础模型,采用“基础进食+强迫负重游泳”的方法诱发气虚证候,所建模型表现出的精神萎靡、眼睑下垂、反应迟钝、体质量下降等一般状况与临床患者络气