层析介质分类及研究进展

层析介质分类及研究进展摘要：层析是蛋白质纯化的关键技术之一，作为层析技术的核心——层析介质一直以来是层析技术研究的一个热点。最近几年来，愈来愈多的新型层析介质被开发出来，如粒度均匀的交联多糖、人工合成的大孔聚合物、触角型吸附剂、软胶包裹在硬胶表面等介质。本文主要综述了层析介质的分类、组成、特性和研究进展，及其与之相关的应用较为普遍的层析技术。同时，结合我国的实际情形，就当前层析介质面临的挑战和未来的进展进行讨论并提出了建议。关键词：层析介质，分类，研究进展Abstract：Chromatographyisoneofthemostimportantpurificationtechniquesofproteins．Theattentionofchromatographershashithertofocusedonmediawhichisregardedasthekeyforchromatographytechnology．Inrecentyears，variousnewmediausedinproteinchromatographyhavebeendeveloped，suchashomogeneouscrosslinkingpolysaccharide，syntheticorganicpolymers，tentaclesorbentsandsoftgelinarigidshell，etc．Thispaperreviewsthechromatographymedia,includingtheirsort,composition,characteristicsandresearchprogress.Meanwhile,associatingwiththefactsofChina,thechallengesofchromatographymediaarediscussedandthescopeforfutureworkishighlighted.Keywords:chromatographymedia;classify;researchprogress层析技术是目前普遍应用的一种分离技术，是利用不同物质理化性质的不同而成立起来的技术。而在众多的蛋白质分离纯化技术中，层析是一门关键技术，和其它分离技术相较，层析技术具有分离效率高、适用性广和进程易于放大、易于自动化的特点，因此取得了普遍的应用。而层析技术的核心是层析介质，选择适合的层析介质、应用合理的工艺条件已成为蛋白质层析技术的关键，这就要求对当前主要的层析介质有所了解。下文对层析介质的进展概况进行介绍，并探讨层析介质的应用技术。层析介质的分类按照层析技术的类型能够将层析介质分为：凝胶过滤介质、离子互换介质、疏水作用层析介质、反相层析介质和亲和层析介质等。就介质的骨架而言，最初主如果天然高分子物质，都为多糖如纤维素、葡聚糖和非交联的琼脂糖凝胶，其特点是亲水性好、生物相容性高，缺点是质地较软、不耐压、流速慢，一般称之为软胶（softgel）。随着对蛋白质分离要求的不断提高，客观上推动了蛋白质层析介质的进展，在过去的十几年中，新型的层析介质被不断地开发出来，大体上能够分为以下几类：1）粒度均匀的珠状交联多糖。在保证了经典多糖介质良好的吸附性能的基础上进行交联，不但增加了强度，而且较窄的粒径散布提高了分离效率。如交联琼脂糖凝胶，商品化的有AmershamBiosciences生产的SepharoseFastFlow、Seph—aroseHighPerformance等系列。2）人工合成的大孔聚合物。基于这种填料的层析被称为灌注层析，其特点是在介质中除有小的扩散孔，还有大的穿透孔，从而大大加速传质，增加流速。最先商业化的产品是PerSeptiveBiosystems公司1989年推出的Poros系列，目前还有Ciphergen公司的HyperD系列。另外还有一类区别于传统珠状介质的填料采用整块多孔聚合物（monolithporouspolymer），其合成是在“密闭柱"中进行的，不过内径较大的柱的合成比较困难。3）触角型（tentaele）吸附剂。这种介质通过增加距离臂和有效官能团来增加活性配基与蛋白质的彼此作用，从而提高效率，如Merck公司的FractogelEMD系列。4）软胶包裹在硬胶表面（softgelinarigidshell）。这种介质最大的特点是结合了软胶（如琼脂糖）良好的吸附性能和无机材料（如硅胶）的刚性长处，如Ciphergen公司的Sphero一dex系列。层析介质的应用技术离子互换层析离子互换层析是利用离子互换剂与离子的作使劲强弱不同，选择性地吸附或释放有价值的离子，从而达到去除杂质、富集或纯化目标生化物质的目的。在生物医药行业中，普遍应用于抗生素、氨基酸和有机酸等生化小分子物质的提取，也大量用于蛋白质、酶和多糖等生物大分子的分离纯化。原则上，在某一条件下，只要目标生化物质能离子化，就可以够采用离子互换技术进行分离、纯化。最先应用于生物大分子分离纯化中的离子互换介质是纤维素离子互换剂，纤维素高度的亲水性能与蛋白质有专门好的相容性，但其缺点也显而易见：容量低、流速慢。后来，珠状交联葡聚糖、琼脂糖、交联纤维素被开发出来，离子互换介质的性能取得了极大的改善，这也是目前仍取得普遍应用的离子互换介质。最近几年来，随着合成技术的进展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子互换介质进展的一个趋势。目前，商品化的离子互换层析介质品种很多（见表1）。茗称配基%-関A日呼liedDEAEXMCdtjlvBcWhilmanDMIi.LM.SE.P(.■erauur□ph朗和!Q.SrPEAE.OlFniHlt^rlF.Mf^TM.lE川EAEaDMAE.£.ljO,SE.别张“mHMomiPrrfiBifrRadgDEJtE觀点MatrfT!以札曲耐MiHipjtf珠:上龙議訐唯宦QrDFAR.l^.htimA^rnsh^nnBi^cirmTes余朮性聚髒类XMilnOAiDcrshainHiasriew帝水件型驟吳PomPcrScpt^D»5F5l£Jlli橐茬己旳Q^DsS^E^r.lM加“衬AwhtLsRi*』•却•曲DRjLEAnm-hamBkectenc曲交QAF,DHAE.CMfiPCLAwsJidniBiascifmcrs交联琼〕&威DFAE,CHSrphzuwFtpiFb.AirrJidnji交联琼侶吐Q.DE：VF：.ANXXM,3Stphua^-111臨Anen-lum交联苹惜倉Q.SPSoincrA^nhdmEkofrimtihCipitr^WnUUE.SPSphfiMsilCiphrrfren经愛合斯低卅旳多孔便査QUA.险呻sffiT<^diaa^電甲扯丙掘離篇9AE.DME,(JM^PTriawrylMii^Sl：iph#僭,门耗ft两焜轅棄讣氧DE^E.CM.SPRKCd.Tm曲砂GJOOO菇*亚表1.用于蛋白质制备的离子互换层析介质凝胶过滤技术凝胶过滤是依照生物大分子物质（如蛋白质）的分子量大小进行分离的技术。其按照不同分子量（或分子大小）的溶质分子在凝胶结构内相溶液与外相溶液之间的分派关系不同而分离的，主要用于生物大分子物质的脱盐、分级分离和分子量测定等。脱盐是分离大小不同的两类物质，常指无机盐与生物大分子间的分离；分级是将分子大小相近的物质分开，一般为大分子间的分离。凝胶过滤具有：①分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好；②工作范围广，分离分子量覆盖面大；③设备简单、易于操作；④周期短，无需再生，可持续利用等许多长处。凝胶过滤介质的性能是获取上述长处的基本保证，表征凝胶过滤介质性能的参数一般有：排阻极限、孔容、分级范围、水滞留量、粒径及粒径散布等。粒径及粒径散布影响其柱效，孔容则关系到凝胶色谱柱的分离容量。凝胶介质应具有以下条件：①介质本身为惰性物质，在应用进程中它不与溶质、溶剂发生任何作用。②应尽可能减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异吸附件，提高蛋白质的收率，不然，采用离子强度大于mol/L的缓冲液消除非持异吸附效应。③介质孔径散布应较窄。④粒径分布应较窄。⑤介质要具有优良的物理化学稳固性及较高的机械强度以增加利用寿命。常常利用凝胶过滤介质的骨架主要有天然多糖类和合成大分子：①多糖类骨架的介质主要为纤维素、葡聚糖及琼脂糖等。以天然多糖为母体的凝胶过滤介质是“经典”的分离生物大分子的材料。这种介质具有亲水性及与生物大分子的相容性，可允许生物大分子透过而不发生变性。这种介质原多为软基质，压力降大，不易操作。最近几年来合成工艺不断改良，生产出刚性、半刚性的骨架，出现了适用于高流速且具有高分辨率的新产品以知足生产规模的需求。除单一的多糖骨架外还出现了琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶Superdex高效过滤介质。②合成大分子骨架的介质是在吸取多糖类骨架亲水性长处，克服其易受微生物侵蚀的缺点，选用高亲水性单体，经共聚反映并控制孔结构而合成的介质。主要有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系及含羟甲基酰胺类的新型介质。疏水作用层析是按照分子表面疏水性不同来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常常利用的方式。通过三十连年的进展，HIC已成为分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的重要手腕。HIC技术在实验室和工业化生产中取得了普遍的应用。HIC介质的重要特点是疏水性弱，与蛋白质的作用比较温和，能更好地维持生物大分子的天然结构和生物活性。另外，其“高盐吸附、低盐洗脱”的特点使得HIC能直接与其它分离技术如盐析、离子互换层析联合利用。目前用于制备用途的HIC介质的基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最普遍的疏水介质。Gustavsson等⑷最近研制了超大孔(superporous)琼脂糖作为疏水层析介质的基质，在扩散孔的基础上增加了对流孔，传质速度快，能在流速较高的情形下取得较好的分辨率。另外，由于壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳固性，最近几年来在疏水层析中也取得了应用［5］。用于HIC介质的疏水配基很多，如羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、戊基、辛基等。通常，配基通过稳固的非离子键(如醚键)与基质结合，图1列出了几种常常利用的配基结构及其与配基的联接方式。迄今为止，普遍利用的商品化制备型HIC介质配基仍是烷基和芳基，常见的商品化制备型HIC介质见表2。SAjilI就憂■密度MI.jm-.l'nil1啾圍乎哗五了―甲<4仏0邸»MA1>23剋强M*:n«-prepmethii丙基1.PK的)MASU-4fl1-時25呷密詳潢AFranhy|f:|FMITRn单jA45-订50EuiyliSqJijrT4FT1SI却1-14未知>13酣AE53-L25I-BEunyleflEufjMI«■歩知未5sToy«jpfi*rljKityt-OSOMA*Xifl走知ToropeuLb«fl-65fl'电1-U第i.y如门刑0N4rnfllSAiFnrjrji*XLH■UMTC%HIV■fll”]MISi/A21怕3-12252+mgHSAPbenR沖皿神flF忤15Z-I2耒燔末知SOUBCRlS-f-HfcS3-12513.Pfenvl胡中如-4&H呻鄭祥送白：FEcborelLMl)I'hfinYl朮如•第知矿・窈亦dRirnxlMA■<未知T旳jitifIPtirnyl-ifi^Q怡去问末吕P™H氏*S-1Mid)A.4J-I6J3--13OcEylScpIiBnwr：・FFC影・1巧"洛未SiOd^icetiLifiw-PSSOUIMSK1SCTHHE耳f&hi帰帥刖_ptTSKpdeiherM未XTayopcErJL^lkrIrMl表2.主要的商品化制备型HIC介质最近几年来，随着层析技术的进展，与HIC相关的其它层析技术也取得了进展，主要有以下两种：亲硫性疏水层析(thio—philicchromatography)、疏水电荷诱导层析(HCIC)。亲硫性疏水层析：亲硫性疏水层析技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元素的彼此作用。利用层析介质与含硫蛋白质和非硫蛋白质的亲硫性不同，对蛋白质加以分离。具体应用条件和HIC类似。通常这种介质通过硫醚键将配基和基质联接，如Butyl—S-Sepharose6FastFlow，已用于乙肝病毒表面抗原的分离纯化［6。］疏水电荷诱导层析：HCIC是近几年来进展起来的一类不同于HIC的新技术，最先由Burton等于1998年提出。HCIC与蛋白质的作用除疏水作用，还有电荷间的彼此作用。HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与HIC不同的是，这一进程一般是在不改变离子强度的条件下实现的，洗脱时也不像HIC那样通过改变盐的浓度而是由pH值的改变来实现的。3．层析技术的应用及其相关的介质层析技术有很多类型，以上提到的这些蛋白质层析技术不是在每一种蛋白质的纯化中都要用到，事实上在能达到纯度要求的情形下，应尽可能利用较少的纯化步骤，以提高产率、节约本钱。但实际进程中，往往需要几种层析技术加以联合利用，才能达到产品的纯度要求，如何更好的利用这些层析技术，AmershamBiosciences公司的技术人员针对蛋白质层析的特点提出了“三相纯化策略"(threephasepurificationstrategy)，这三步别离是：富集(capturestep):对目标蛋白质进行初步纯化，去除那些与目标蛋白质性质不同专门大的物质，如细胞的DNA、RNA等；另外，尤其重要的是去除那些对目标蛋白质不稳固的物质如各类蛋白酶，以达到富集浓缩、稳固目标产物的目的。通常应用的层析技术有离子互换、疏水作用、亲和层析，对层析介质的要求是流速快、载量大。2）中间纯化（intermediatestep）:进一步纯化目标蛋白，去除那些在分子大小、理化性质与目标蛋白质类似的杂质，通常采用与富集时不同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好（分辨率高）、载量大，通常应用颗粒较小的介质。3）精制（polishingstep）:最终去除那些痕量杂质，达到产品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中常常利用的层析技术，对分离介质的要求集中在高选择性上。层析介质的研究进展层析介质正朝着品种多样化、性能高效化的方向进展。为了知足生产的需要，愈来愈多的人工合成或复合型的刚性材料被开发出来，提供了高流速、高选择、高载量及可操作性的介质，相信这也是未来蛋白质层析介质进展的趋势。目前层析介质的研究方向有以下几点：1）用低价、生物相容性好的基质材料制备层析介质多糖类的天然高分子材料能够作为介质的基质，如纤维素、壳聚糖。由于价廉和生物相容性好的两大长处能够取代琼脂糖成为蛋白质分离的理想填料。也可将它们和其它聚合物涂层或混融制备填料基质。2）良好的致孔技术介质的动力学性能取决于内部的孔结构，只有拥有均匀的、大小适合的孔径散布才能有好的动力学性能，才能最大限度发挥填料的互换（吸附）作用和选择性能。采用多种类的致孔剂造孔于天然高分子和全合成聚合物是填料进展面临的最大挑战。3）开发大颗粒的耐压性能好的全合成聚合物颗粒的增大降低了操作反压，提高了流速，给大规模生产操作带来极大的便利，相应的设备投资能够大大降低，可是颗粒的增大会造成破裂，因此在具有良好的孔结构的基础上还要保证介质具有耐压的性能。4）研发具有自主知识产权的通用型介质通用型介质在分离进程中主要用于富集和中间纯化步骤，用量大，它的本钱投入较大，对生物药物的价钱起到杠杆作用。因此我国生物制药的进展要立足咱们自己研发的分离介质，而不能长期依赖入口介质。讨论层析技术作为目前应用较为普遍的分离技术已经取得重视，而层析介质在层析技术中起着超级重要的作用，可是当前的介质仍然存在着或多或少的问题，因此咱们需要综合各类介质的优缺点后再应用于各类实践中，或改良现有的介质，以便更好发挥层析介质的作用，从而达到咱们的目标。参考文献Baosx（鲍时翔），YaoRH（姚汝华）.Separationandpurificationofproteinandrecentadvancesinchromatography．JournalofSouthChinaUniversityofTechnology（NaturalScience）（华南理工大学学报•自然科学版），1996，24（12）：98—103XieS，AningtonRW，Fr6ehetJMJeta1.Porouspolymermonoliths：analternativetoclassicalbeads.AdvBiochemEngBiotechnol，2002，76：88—125孟庆强，乔昕，马辉煌.疏水层析蛋白质动力学与平衡进程的考察