TNAIA 0220-2023 青贮饲料中9种真菌毒素的测定 液相色谱-质谱 质谱法

ICS65.120CCSB20

TB团 体 标 准T/NAIA0220-2023青贮饲料中9种真菌毒素的测定液相色谱-质谱/质谱法Determinationof9MycotoxinsinsilageLiquidchromatography-massspectrometry2023-08-28发布 2023-08-31实施宁夏化学分析测试协会 发布前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。回族自治区吴忠市利通区农业服务中心、宁夏化学分析测试协会。本文件为首次发布。PAGEPAGE1青贮饲料中9种真菌毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法范围FB1FB2AFB1AFB29种真菌毒素测定的液相色谱-质谱/质谱分析方法。9农作秸秆，其它类型青贮饲料可参考本文件。规范性引用文件（有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理0.1%甲酸乙腈溶液提取，经混合净化材料萃取净化后，取适量上清液经氮气吹干后乙腈水溶液定容，经超高效液相色谱—串联质谱法测定，外标法定量。试剂与材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中规定的一级水。乙腈（CH3CN）：色谱纯。甲醇（CH4O）：色谱纯。氯化钠（NaCl）：分析纯。无水硫酸镁（MgSO4）：分析纯。柠檬酸钠（C6H5O7Na3）：分析纯。柠檬酸二钠盐（C6H6Na2O7）：分析纯。0.1%80%乙腈溶液（8+2，体积比）20mL80mL乙腈中混匀，加入0.1%甲酸。50%乙腈溶液（5+5，体积比）：50mL50mL乙腈中混匀。FB1（CAS116355-83-0，纯度≥98FB2（CAS号116355-84-1，纯度≥97.9%）、伏马毒素FB3（CAS号136379-59-4，纯度≥98.5%）、脱（CAS99.383-（CAS50722-38-8，纯度≥99.015-（CAS88337-96-6，纯度≥99.8）、玉米赤霉烯酮（CAS17924-92-4，纯度≥99.7）AFB1（CAS1162-65-8，纯度≥99.0%）AFB2（CAS7220-81-7，纯度≥99.0%）。5.10 标准溶液配制：根据需要分别吸取适量9种真菌毒素标准溶液，用乙腈稀释成1.0μg/mL混合标准溶液，-18℃下保存。仪器与设备高效液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 0.01g0.0001g。高速万能粉碎机：10000r/min。振荡器。离心机：4000r/min。涡旋混合器。氮吹仪。离心管：50mL，塑料。滤膜：0.22μm，有机相。分析步骤试样的制备青贮饲料样品于-18℃冷冻冰箱中保存。试验时将青贮样品取出，用高速万能粉碎机粉碎，分别置于样品袋中，-18℃冷冻备用。试样提取与净化称取青贮饲料样品2.00g（精确至0.01g）于50mL离心管，加入20.00mL提取液（5.7），40min4000r/min3min6.00mL2g无水0.5g0.5g15mL40003min3.00mL15mL1.5mL定容液（5.8）溶30s0.22μm滤膜后，上机测定。液相色谱—串联质谱法测定液相色谱参考条件色谱柱：T3柱，100mm×2.1mm1.8μm，或性能相当者。柱温：40℃。进样量：2μL。1。A：水溶液（0.1%甲酸+5mmol/L乙酸铵B：甲醇（0.1%甲酸）。表1 流动相、流速及梯度洗脱参考条件时间，min流速，mL/min流动相A，%流动相B，%00.490101.00.485152.00.480206.00.4406010.00.4178311.00.4901013.00.49010质谱参考条件a）离子源：电喷雾离子源。b）扫描方式：正离子模式和负离子模式。c）5500V4500Vd）离子源温度：550℃。雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。23。表2 ESI+监测模式分析参数名称保留时间/min定性离子对/m/z定量离子对/m/z碰撞能量/eV伏马毒素FB18.45722.4/334.4722.4/352.4722.4/334.45450伏马毒素FB29.69706.4/336.51706.4/318.61706.4/336.515054伏马毒素FB39.15706.4/336.50706.4/318.60706.4/336.505050脱氧雪腐镰刀菌烯醇3.82297.1/249.1297.1/203.2297.1/249.116213-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇6.07339.2/203.2339.2/231.1339.2/203.2211815-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇6.07339.3/321.2339.3/137.1339.3/321.21219黄曲霉毒素B17.42313.1/285.1313.1/241.1313.1/285.13350黄曲霉毒素B27.19315.1/287.1315.1/259.1315.1/287.13540玉米赤霉烯酮9.74317.1/175.0317.1/273.0317.1/175.0-32-27色谱测定与确证液和待测样液中毒素的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述仪器条件下，伏马毒素FB1FB23-15-B1B2的保留时间分8.45、9.69、9.15、3.82、6.07、6.07、7.42、7.19、9.74min，多反应离子监测色谱图A4判断样品中存在对应的被测物。表4定性确证相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度>50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%空白试验除不称取试样外，均按上述操作步骤同时进行。结果计算和表达用色谱数据处理或按式（1）计算试样中各真菌毒素的含量，计算结果需将空白值扣除。XACSV1V3ASmV2

……（1）式中：X——试样中真菌毒素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样中真菌毒素的峰面积；V1——试样中加入的提取溶液体积，单位为毫升（mL）；V2——分取溶液体积，单位为毫升（mL）；V3——定容溶液体积，单位为毫升（mL）；CS——标准工作液中真菌毒素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；AS——标准工作液中真菌毒素的峰面积；m——试样的质量，单位为克（g）。注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。精密度15%。定量限和回收率定量限FB1FB2FB30.050mg/kg、黄曲霉B1B20.00100.103-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-0.50mg/kg。回收率本方法的添加浓度和回收率范围见附录B。附录A（资料性）9种真菌毒素标准溶液在青贮饲料基质中选择离子监测LC-MS图LC-MS图，见图A.1。图A.19种真菌毒素标准溶液在青贮饲料基质中选择离子监测LC-MS图附录B（资料性）青贮饲料样品中添加浓度及回收率范围9种真菌毒素在青贮饲料中的添加浓度及回收率范围见表B.1。表B.1 9种真菌毒素在青贮饲料中的添加浓度及回收率范围（%）名称添加浓度（mg/kg）回收率范围（%）RSD(%)脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON0.573～908.41.091～1023.62.093～1051.53-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.587～1045.81.090～1012.62.099～1043.415-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.591～1003.51.093～1023.62.095～1011.8玉米赤霉烯酮0.0175～882.00.0686～1033.40.386～921.5黄曲霉毒素AFB10.00182～1024.50.0057