再生障碍性贫血动物模型研究进展

再生障碍性贫血动物模型研究进展

再生障碍综合征（aa）的发病机制非常复杂。这是一种由缺血干燥剂、呼吸困难和免疫功能紊乱引起的以缺血组织功能衰竭为特征的疾病。虽然第46届美国血液学年会明确提出AA是自身免疫性疾病,免疫异常表现在T淋巴细胞功能亢进,但其发病机理仍不清楚。再生障碍性贫血临床表现主要为骨髓造血功能抑制以及外周血全血细胞降低,包括外周血红细胞、白细胞、血小板数、骨髓有核细胞数以及红系、粒单系、淋巴系造血祖细胞数均低于正常,出现贫血、出血、感染。为探究AA发病机理及筛选有效防治药物,建立合适的AA动物模型显得尤为重要。目前,国内外建立AA模型的方法有物理方法、化学方法、免疫介导以及物理化学等方法。1干预性贫困动物模型的生产1.1辐射复制aa动物模型辐射作用于机体后,最早出现形态变化的是造血系统,由于骨髓组织增殖旺盛,分化程度低,对放射线高度敏感,骨髓损害程度取决于放射剂量的大小、照射范围、部位和照射时间等。射线辐射除了损伤造血干细胞外,还可损伤造血微环境,影响干细胞的增殖和分化。射线能阻止DNA的复制而抑制细胞有丝分裂,减少造血干细胞数量,其微环境的改变往往在相当时间内得不到恢复。同时引起免疫功能的严重损伤。射线辐射复制AA动物模型多采用60Co-γ射线照射,60Co-γ射线辐射能够诱发产生自由基,促进造血细胞凋亡,引起细胞周期紊乱,造血干、祖细胞数量和增殖能力下降,造成骨髓损伤。但近十年来鲜有单独采用射线照射的方法来进行AA的模型制作。因其需要特殊设备,特殊防护,操作不方便,辐射剂量难以控制,过小达不到骨髓永久性损伤要求,过大又会导致动物死亡,有时药物的作用难以观察。所以现在射线照射多与化学药物相结合进行造模。1.2制备小鼠骨髓造血模分别于第1、3、8、11、15、18、21、23天,给予BALB/c小鼠腹腔注射白消安10.50mg/kg,每天1次,共8次,造成小鼠骨髓长期抑制模型,该模型骨髓造血功能不能恢复正常,从造模后第1天直至造模后第112天,外周血红细胞、白细胞、血小板数、骨髓有核细胞数以及红系、粒单系、淋巴系造血祖细胞数均低于正常。此方法导致动物体内造血干细胞功能缺陷,可建立骨髓永久性抑制(再生障碍性贫血)小鼠模型。给予NIH小鼠口服白消安18.0mg/kg,连续喂药后10天,实验结果显示实验小鼠少食、血细胞下降;骨髓有核细胞数明显减少,代以成熟红细胞浸润;脾脏组织学检查显示正常有核细胞减少,淋巴细胞相对增多;体重减轻,1/20小鼠死亡。NIH小鼠对口服白消安的反应性较恒定,用药前后各项检查指标均有显著性差异,血液学参数变化均较恒定,死亡率较低,可作为再生障碍性贫血的一种动物模型。操作简便,但诱导时间较长,剂量过大死亡率高。如能严格掌握实验条件、用药剂量及给药时间,可获得骨髓造血功能低下的动物模型。选用远交昆明种小鼠,将白消安片剂研磨成2mg/ml的悬液,分两组给予不同的剂量。一组每次胃饲白消安悬液0.2ml,早晚各一次,诱导时间为10～15天;另一组前5天每次胃饲0.3ml,以后改为0.2ml,早晚各一次,诱导时间为7～12天,当出现明显症状如唇瓣灰白、毛发耸立、角膜混浊、行动迟缓、体重明显下降时即停止胃饲。两组实验虽采用不同剂量,但是发生骨髓造血障碍的时间都较为稳定,发生率100%,各项指标与人的AA相似。对CD1小鼠在一周之内,进行3天或5天的苯的皮下注射,注射剂量为1940mg/kg,在完成15或20次注射后,造模结束,每组小鼠均出现符合AA的指标,只是每组指标略有不同,每周进行3次注射的小鼠,体重和脾重量的减少要小于每周进行5次注射的小鼠。另外还有采用多种化学药物联合造模的方法:Wistar大鼠每次皮下注射苯0.5ml/kg,每周3次,同期白消安15mg/kg灌胃,每周1次,均应用5周。大鼠于实验第四周左右逐渐出现毛发蓬松,食量及饮水减少,反应迟钝,活动迟缓,卷曲少动,体重下降。实验结果急性再生障碍性贫血的患病率为100%,死亡率为100%,平均存活时间为43.5±6.9天。此方法操作简单,但是造模时间长且造模后动物死亡率高,存活时间短。给予40只昆明种小鼠环磷酰胺溶液:50mg/kg(0.2ml/只)皮下注射,隔天1次,共4次;同时给予甲苯吸入染毒:浓度30mg/L,每次2h,每天一次,共8天。于第10、35天取血,观察血象及网织红细胞;在第11天取5只小鼠处死取骨髓、肝、脾镜检,其余小鼠35天后处死取骨髓及脾脏活检。结果显示,小鼠外周血象三系细胞均有显著降低;骨髓增生低下,脂肪细胞增多,造血细胞减少,脾脏萎缩,此方法造模成功率高。由于单纯采用白消安诱发再障模型,给药时间长,发病时间不一致,发病率较低和继发淋巴瘤的发生率高等缺点,从而影响了它的应用。根据5-氟尿嘧啶(5-FU)富集干细胞和白消安损伤干细胞的特点,采用两者联合用药方案,给予Wistar大鼠一次5-FU150mg/kg腹腔注射,第5天后给予口服白消安15mg/kg,每周一次,连续3周。实验结果显示,血液学检查三系细胞明显减少,濒死时血红蛋白、血细胞比容和血小板降到最低;骨髓脂肪化,脾脏、淋巴结和胸腺等淋巴器官组织明显萎缩,凋亡细胞多见,无髓外造血灶;骨髓细胞CFU-GM未检出,表明此动物模型血液淋巴系统和多能造血干细胞受严重抑制。急性再障患病率82.0%,平均存活时间为30.0±6.5天;慢性再障18.0%,总患病率100%,再障死亡率98%。1.3再生慢性血红蛋白动物模型的制备目前通过免疫介导再生障碍性贫血动物模型的方法主要有两种,一种是病毒感染,一种是淋巴细胞输注。病毒可以作为抗原激活T淋巴细胞增殖,并识别具有抗原表达的造血干细胞而发生自身免疫反应,导致骨髓衰竭;也可能病毒直接破坏造血干细胞或同时感染骨髓基质细胞,破坏造血微环境而影响骨髓的造血功能。通过病毒感染制作再生障碍性贫血动物模型这方面所进行的研究较少,目前的报道有通过用巨细胞病毒和人类微小病毒B19持续感染小鼠,出现骨髓网状间充质细胞的缺失及骨髓功能损害。但同一病毒感染不同品系小鼠所介导的AA动物模型机制不同,此方法操作复杂,较难掌握。目前免疫介导的AA动物模型大多通过淋巴细胞输注。BALB/c小鼠作为受者,DBA/2小鼠为淋巴细胞供者。无菌取DBA/2小鼠胸腺及淋巴结,分别获得胸腺、淋巴结细胞悬液,活细胞>95%,胸腺细胞与淋巴结细胞以1:2比例混合成为胸腺淋巴结细胞悬液。BALB/c小鼠经5Gy60Co-γ射线全身照射(剂量率125.35cGy/min),照射后20小时内由尾静脉注入DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞悬液。小鼠照射后立即移入SPF级无菌层流室内,饮用加有庆大霉素(40万U/L)和二性霉素B(50mg/L)高压灭菌水,观察并记录小鼠情况,28天存活率18.2%。此方法所制作的动物模型与人再障时表现相似。1.4小鼠骨髓活检小鼠一次性全身3.0Gy60Co-γ射线照射(剂量率1.3531Gy/分钟,距离170cm,照射时间2分13秒),照射后于第4、5、6天注射环磷酰胺50.0mg/kg及氯霉素62.5mg/kg。动物于照射后第8、12、16天取血做血常规分析,计数网织红细胞;第8天取小鼠股骨,进行骨髓活检。结果显示,红细胞、血红蛋白、血小板及网织红细胞随时间延长呈进行性下降;骨髓增生极度降低,间质水肿,脂肪细胞增多。另有报道,第1天给予Balb/c小鼠皮下注射乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine,APH)80mg/kg,第2天给予2cGy剂量的60Co-γ射线照射处理;照射后第3天给予环磷酰胺(cyclophosphamide,CY)50mg/kg一次性腹腔注射。小鼠在造模后第7、11、15天采血测外周血象,取骨髓细胞计数骨髓有核细胞。取第7天骨髓细胞做细胞培养,7天后计数粒巨噬系(CFU-GM)、红系(BFU-E)、巨核系(CFU-Meg)集落数。结果显示,实验动物三系细胞数目明显降低,造血祖细胞培养集落产率显著下降,骨髓有核细胞计数随时间延长有上升趋势。此方法造模周期短,动物存活时间长;但需专用设备、专业人员、过程繁琐。2细胞再障与血小板再障AA动物模型判断标准:外周血三系细胞减少、网织红细胞减少,骨髓活检示骨髓增生不良或低下、非造血细胞(脂肪细胞)增多。临床上,再生障碍性贫血的血象降低首先是血小板减低。在再障诊断中,骨髓巨核细胞是一个非常重要的指标,如果患者骨髓中能见到较多的巨核细胞就可以直接除外再障。在再障血象恢复时血小板上升最慢,部分病人血色素和白细胞都正常了,但是血小板终身不恢复。因此建议在AA动物模型评判标准中增加对骨髓巨核细胞数减少的检测。3药代动力学研究可减少细胞基因突变试验对于AA发病机制目前尚无确切结论,可能与骨髓造血干细胞异常、造血微环境异常、免疫异常以及端粒酶的改变有关。较多认为是由于细胞免疫异常,通过淋巴因子或效应T细胞杀伤造血干细胞或祖细胞而致。单纯经射线照射制备AA动物模型,需特殊设备及防护,且辐射剂量难以控制,较少采用。苯主要损伤骨髓造血干/祖细胞,但单纯用苯造模给药周期长,若给药时间短,则苯对骨髓的抑制呈明显的可逆性,发病率低。细胞周期非特异性药物白消安属烷化剂,为甲基磺酸酯类的代表药物,主要作用于细胞的G1期与M期,可与DNA双链形成交叉联结,破坏DNA结构,对骨髓粒系、红系、血小板均有抑制作用,不仅损伤造血干细胞,也损伤造血微环境。单纯应用白消安,其给药时间长,AA发病时间不一致,发病率较低,淋巴瘤发生率高。氯霉素的骨髓抑制主要是作用于造血微环境或造血干细胞。乙酰苯肼为一缓慢性氧化药物,可导致红细胞膜损伤而减少外周红细胞数量。烷化剂环磷酰胺为周期非特异性抗肿瘤药物,能与细胞中DNA或蛋白质分子中的氨基、羧基、巯基、磷酸基等亲核基团结合,以烷基取代这些基团中的氢原子而起烷化反应。其与DNA的两条互补链发生烷化,形成交叉联结,从而抑制DNA复制和转录,也会导致基因错码,或引起咪唑环裂开、鸟嘌呤脱落、DNA链断裂等,造成DNA功能和结构的损害,引起细胞死亡。药物剂量、蓄积作用、给药方法、个体对药物的敏感性均是影响造模的相关因素。单纯应用化学药品进行AA造模,若剂量小,则造模时间长;近年来的报道中,由于使用的剂量增大,缩短了造模时间,但剂量过大,死亡率增高。若药物对骨髓的抑制作用未达到一定程度,易造成动物骨髓的可逆性抑制,则骨髓抑制能够