溶血脂蛋白对急性水肿型胰腺炎大鼠血脑屏障的影响

溶血脂蛋白对急性水肿型胰腺炎大鼠血脑屏障的影响

胰腺疾病（pe）显示了胰腺的独特特征，并在胰腺中经历了革兰氏病。该并发症凶险,死亡率高,但发病机制不明。对PE发生机制目前普遍的理解是胰酶进入血液循环,进而通过血脑屏障(BBB)引起脑损害。其中磷脂酶A2(PLA2)和溶血卵磷脂(LPC)的作用引人注目。PLA2活化后可将胆汁内卵磷脂转化成LPC,后者有破坏细胞膜磷脂层的特性,作用于BBB有提高其通透性的可能。经外周血循环应用LPC,LPC有可能通过BBB引起脱髓鞘改变。本研究旨在观察LPC对胰腺炎大鼠BBB通透性的影响以及对胰腺炎大鼠的脱髓鞘作用,探讨PE的发病环节。材料和方法1.动物实验中心SD大鼠30只,雌雄不拘,体重230~270g。南京医科大学动物实验中心提供。大鼠随机分为3组:实验组、对照组1、对照组2。每组10只。2.辣根过氧化物酶及二氨基联苯氨牛黄胆酸钠(STC)和LPC均购自美国Sigma公司。辣根过氧化物酶(HRP,RZ>2.5)及二氨基联苯氨(DAB)均购自南京生兴生物公司。丽春红G染液及固蓝染液(LFB)由南京脑科医院惠赠。3.胰腺制模成功实验组及对照组1参照Aho等制成胰腺炎模型。大鼠麻醉后开腹,以手动持续压力将0.6ml/kg体重大鼠的3.5%STC注入胰管,注射时间30s。胰腺发生轻度充血,表明水肿型胰腺炎制模成功。对照组2同样麻醉开腹,但找及胰管后即关腹。从制模次日起连续5d每天从实验组、对照组2尾静脉注入0.1%LPC4ml/kg体重大鼠。对照组1同时从尾静脉注入等量生理盐水。4.脑dab显色(1)标本取材:在连续应用LPC5后的7~10d,麻醉大鼠后解剖出左颈动脉,向颈内动脉头侧插入7号静脉留置针并固定,结扎远心侧。5min内持续注入0.4%HRP2ml/kg大鼠体重,10min后取脑。将脑沿矢状位中线切开,一半置于液氮罐中,用于DAB显色。另一半新鲜标本保存在4%甲醛-钙液中,用于丽春红G和髓鞘固蓝染色。(2)DAB显色:冰冻切片厚6~10μm,先与30%H2O2作用5min形成较稳定的H2O2-HRP复合物,继以0.04%DAB进行显色5~10min。5.丽春红g染色及复染2d内将标本用蜡块包埋后切片,厚6~8μm,切片常规脱腊至蒸馏水。丽春红G染色3~5min,接着蒸馏水洗,然后用1%磷钨酸水溶液处理1min。接着用亮绿进行复染1min。再用1%冰醋酸水溶液分化数秒。自来水洗,脱水,透明,封闭。6.细胞核组织染色石蜡切片厚6~8μm,先脱蜡至二甲苯,接着入无水乙醇4min。再用LFB染色2h后随即置60℃温箱,还原至室温15min。乙醇洗后转入蒸馏水洗。切片先以0.09%碳酸锂分化1s,再用70%乙醇分化至灰白质分辨明显,继之将切片用自来水洗。接着用苏木素染色细胞核3~5min,流水冲洗。切片用1%盐酸乙醇分化,返蓝水洗,再用0.5%伊红溶液复染5~8min。迅速以纯乙醇脱水,透明,封闭。结果1.对bcb外hrp的检出情况的分析实验组大鼠BBB开放明显,棕黄色的生成物分布于BBB以外较远的范围;对照组1有2只HRP渗出至BBB外,对照组2有3只出现BBB外的HRP渗出。以1个神经元细胞的平均大小作为1个细胞单位,无渗出的定为“-”,渗出范围在1个、2到3个、3个细胞单位以上的分别定为“+”“++”“+++”。实验结果统计见表1。以等级资料分析的Wilcoxon法进行分析。实验组与对照组1差异有统计学意义(P<0.05)。实验组与对照组2间差异有统计学意义(P<0.05)。2.髓剑的染色(1)脑部髓鞘在丽春红染色时纵切面呈红色鱼骨刺状;脱髓鞘表现为髓鞘红染变淡,结构不连续或呈颗粒状。(2)固兰染色时髓鞘呈蓝色,其他组织伊红色;脱髓鞘表现为髓鞘的空泡化。(3)实验组出现7例脱髓鞘改变;对照组1无出现脱髓鞘改变的大鼠;对照组2仅1例出现脱髓鞘改变。用定性资料的确切概率法分析,实验组和两对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)。讨论1.对尾炎的影响(1)LPC开放胰腺炎大鼠BBB的可能机制。HRP在正常情况下于BBB的内皮细胞紧密连接处被挡住,因而不能通过BBB。BBB通透性的增加的可能原因是紧密连接处的破坏。本实验结果显示,HRP的血管外渗出的特点是在血管的某一侧面外渗明显,这反映了BBB通透性的局限性的增高,此与毛细血管内皮细胞间紧密连接的不均匀分布特点是相适应的;也与在正常BBB时,HRP就是在内皮细胞的紧密连接处被挡住相吻合。另一方面,其他机制均不能很好地解释本实验的BBB的开放:受体形成的主动转运和易化的载体运输系统均不能解释BBB通透性的局限性的增高,另外,BBB不存在吞饮作用。对照组2BBB的轻度开放,可能是LPC将细胞间的紧密连接被破坏,出现BBB通透性的增加。PLA2和内毒素中的脂多糖可致BBB的开放。对照组1BBB的开放可能是PLA2和内毒素中的脂多糖等的作用。胰腺炎大鼠出现继发感染和内毒素血症是很可能的。(2)LPC开放胰腺炎大鼠BBB的效应在PE发病机制中的重要地位。BBB对于维持脑的内环境稳定,对脑与外周的信息及物质传递都起重要作用。在急性胰腺炎时,BBB一旦开放,大量胰酶及代谢毒性产物将乘虚而入脑组织,破坏脑组织,引发PE。BBB破坏后,细胞因子更易通过BBB破坏脑实质。BBB通透性增加后,血液中致敏T细胞和部分致炎因子进入脑实质,引起神经髓鞘的破坏,中枢神经系统发生脱髓鞘改变。我们已知脱髓鞘是PE的典型病理变化,在胰腺炎基础上出现脱髓鞘的病理改变是检验PE这一动物模型制备成功的重要标准之一。2.lpc对pe发病机制的作用(1)LPC引起胰腺炎大鼠脑部脱髓鞘效应机制分析。按Schaumberg的脱髓鞘分类,该实验中脱髓鞘属于中毒性脱髓鞘,是一种急性脱髓鞘。LPC具有细胞毒性,可以破坏细胞膜磷脂,髓鞘是细胞膜结构的延伸与特化,因而LPC能造成脱髓鞘。胰腺炎大鼠在应用LPC后出现较高的脱髓鞘比例还与其他胰酶、内毒素、肾上腺素的联合作用有关。对照组1仅用生理盐水无一只发生脑部脱髓鞘,这和临床上胰性脑病发病率不高是一致的。LPC先通过对照组2BBB以后发挥溶解生物膜作用,造成中毒性脱髓鞘。(2)LPC对胰腺炎大鼠脑部脱髓鞘效应在PE发病机制中的作用。正常髓鞘把电流限制在郎飞节,实现冲动的跳跃传导。脱髓鞘时神经冲动跳跃传导受影响,神经传导速度减慢。另一方面,脱髓鞘后,钠通道、钾通道重新分布。神经传导必然发生紊乱。另外,脱髓鞘后神经冲动在传导过程中缺少髓鞘的隔离,造成兴奋不能在大脑皮层形成一个确切的兴奋灶,神经冲动有泛化倾向。神经传导变慢、紊乱、泛化在一定程度上解释了PE患者产生神经、精神症状的原因。考虑到在LPC在胰腺炎时是由PLA2激活的,是胰酶的作用产物。有理由认为LPC在PE中起重要作用。较之苗毅等的PE系列研究,本实验中