基因重组与基因工程概述课件

基因重组与基因工程概述基因重组与基因工程概述中心法则

逆转录转录

RNA翻译

蛋白质复制DNA生物体环境

基因的表达调控

适应环境中心法则逆转录转录RNA翻译蛋白质复制了解中心法则

对天然的DNA进行改造为人类服务基因工程了解中心法则对天然的DNA进行改造为人类服务基因工程

即DNA重组技术。在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，使其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞。目的基因在受体细胞中表达，获得新的遗传性状。

基因工程即DNA重组技术。在分子水平上进行遗传操苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因

苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因荧光蛋白酶基因荧光蛋白酶基因转胃安素番茄高锌西洋番茄转虾青素胡萝卜痢疾疫苗土豆转胃安素番茄高锌西洋番茄转虾青素胡萝卜痢疾疫苗土豆乳汁中分泌人凝血因子的转基因山羊

乳汁中分泌人蛋白因子的转基因猪乳汁中分泌人凝血因子的乳汁中分泌人蛋白因子基因重组与基因工程概述课件主要内容DNA重组

重组DNA技术

重组DNA与医学的关系主要内容DNA重组

不同DNA之间发生共价连接形成新的DNA分子。基因移动和重组是生物界普遍现象，是生物进化的动力，DNA重组具有重要的生物学意义DNA重组概念第一节DNA重组不同DNA之间发生共价连接形成新的DNA分子。DNA重DNA重组的类型位点特异性重组（site-specificrecombination）接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)同源重组（homologousrecombination）转座重组（transpositionrecombination）细菌的基因转移与重组DNA重组的类型位点特异性重组接合(conjugation)一、细菌的基因转移与重组

接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)一、细菌的基因转移与重组接合(conjugation)

（一）接合作用(conjugation)

指通过细胞的直接接触(如菌毛)，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。

（一）接合作用(conjugation)指通过细胞接合转移F因子染色体DNA性鞭毛接合转移F因子染色体DNA性鞭毛Griffith肺炎球菌转化实验（二）转化（transformation）Griffith肺炎球菌转化实验（二）转化（transfo

相关概念：转化：细胞从周围介质中吸收裸露的DNA,而获得新的遗传表型。感受态细胞（competentcell）:

具有摄取周围介质中游离DNA

分子能力的细菌细胞。相关概念：转化：细胞从周围介质中吸收裸露感受态细胞（com

转化过程：DNA片断细菌摄取DNA片断重组细菌性状改变转化过程：DNA片断细菌摄取DNA片断重组细菌性状改变（三）转导（transduction）通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移和重组过程。（三）转导（transduction）通过病毒（噬菌体）介导溶菌感染重组感染细菌噬菌体

转导溶菌感染重组感染细菌噬菌体转导溶菌途径溶原途径噬菌体感染宿主后的两种结局溶菌途径溶原途径噬菌体感染宿主后的两种结局cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态噬菌体感染宿主菌后的两种状态是由噬菌体的cI和cro两个基因编码调控蛋白控制的，溶原状态，cI表达；溶菌状态，cro表达。除了控制其他基因表达外，cI和cro两个基因编码调控蛋白是互为阻遏蛋白。结合协同cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态噬菌体感cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度照射后，cI蛋白被降解,接下去会发生什么？停止照射后会怎样？为什么会进化成这种机制？结合协同cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态思考：当

二、同源重组

（homologousrecombination）

不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或相似性而进行的重组。同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则不易发生重组。概念二、同源重组

（homologousrec同源重组意义同源重组发生在任何生物中。细菌如果通过接合或转化获得的外源DNA与宿主DNA充分同源，那末外源DNA就可以整合进宿主的染色体。同源重组也是DNA损伤修复的重要机制同源重组意义同源重组发生在任何生物中。ElectronmicrographofaHollidayJunctionElectronmicrographofaHolliHollidayJunction

(A)ThestructureofaHollidayjunctionboundbyCrerecombinase(gray),abacteriophageprotein.(B)AschematicviewofaHollidayjunction.HollidayJunction

(A)Thestr5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´分支迁移

(recA)5´3´5´3´5´3´5´3´

内切酶

(recBCD)5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´5´

内切酶(recBCD)5´3´3´3´DNA侵扰(recA)3´5´5´3´5´3´5´3´

DNA

连接酶Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´E.coli

的同源重组过程：5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´3´5´5´5´5´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´DNA连接酶3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体DNA连接酶5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´3´5´Holliday模型同源重组步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)Holliday模型同源重组步骤①两个同源染色体DNA排列整片段重组体

（见模型图右边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体片段重组体（见模型图右边产物）：5´5´5´5´3´3´拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体拼接重组体（见模型图左边产物）：3´5´5´5´5´3´3´

位点特异性重组：由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短序列之间发生的切割和连接反应:

噬菌体DNA整合细菌特异位点重组免疫球蛋白基因的重排三、位点特异性重组位点特异性重组：由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌体DNA的整合attPattBE.coliDNAInt,IHFInt,IHF,Xis

DNA噬菌体DNA的整合和切除att:attachmentsite,Int:integrase,IHF:integrationhostfactor,Xis:excisionasePOP´BOB´BOP´POB´attLattR整合切除attPattBE.coliDNAInt,IHFInthix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特DNAH片段

h1H2与阻遏基因mRNAHin重组酶H2鞭毛素阻遏蛋白(a)

hinh2阻遏基因rh1启动序列hinmRNAPPhixhix

hinh2阻遏基因rh1H片段倒位

h1hinmRNAH1mRNAHin重组酶H1鞭毛素(b)

hinPP沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变（二）细菌的特异位点重组DNAH片段h1H2与阻遏基因mRNAHin重组（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(

和

)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(Theorganizationofmouseimmunoglobulingenesegments.Theorganizationingermlinecellsisshownontheleft,andtherearrangedorganizationcharacteristicofmatureBlymphocytesisshowntotherightofthearrows.Therearrangedstatesshownarebutsingleexamplesofthemanypossibilitiesforeachgenefamily.TheorganizationofmouseimmuConsensuselementsarelocatedaboveandbelowgermlinevariable-regiongenesthatrecombinetoformgenesencodingimmuno-globulinchains.Theseconsensuselementsarecomplementaryandarearrangedinaheptamer-nonamer,12-bpto23-bpspacerpattern.-Chain-Chain

H-Chain231223122312CACAGTGACAAAAACCACAAAAAACCCACAGTGConsensuselementsarelocated此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。RAG1识别九核苷酸序列，RAG2加入复合物，切割七核苷酸序列位点等CACAGTGACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG7核苷酸序列12/23间隔序列9核苷酸序列重组信号序列（RSS）重排机制：重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationacV片段J片段RSSRSS间插DNAOHHOVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程-OH亲核攻击V片段J片段RSSRSS间插DNAOHHOVJ单链切开RAG四转座重组（transposition）由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转座DNA片段，片段长度从几百到几万个bp,是遗传多样性的一个重要来源。四转座重组（transposition）由插入序列和转座转座重组分类：插入序列(insertionsequence，IS)转座:

由转座酶（transposase）、一个分离的反向重复序（invertedrepests）列和侧翼二个正向重复序列（directrepeats）组成。

发生形式：保守性转座(conservativetransposition)

复制性转座(duplicativetransposition)转座子（transposon，Tn）转座：除了有插入序列的结构外，还带有抗性或其他标记基因。转座重组分类：转座序列结构反向重复序列转座序列结构反向重复序列反向重复序列转座酶基因IS转座酶基因ampR反向重复序列Tn3转座酶基因tetRTn10IS细菌中的三种转座子类型反向重复序列转座酶基因IS转座酶基因ampR反向重复序列Tn插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座转座子(transposons)

——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因转座子转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移基因重组与基因工程概述课件由转座子介导的转座由转座子介导的转座Exonshufflingbytransposition.(a)TranspositionofanexonflankedbyhomologousDNAtransposonsintoanintrononasecondgene.transposasecanrecognizeandcleavetheDNAattheendsofthetransposoninvertedrepeats.Ingene1,ifthetransposasecleavesattheleftendofthetransposonontheleftandattherightendofthetransposonontheright,itcantransposealltheinterveningDNA,includingtheexonfromgene1,toanewsiteinanintronofgene2.Thenetresultisaninsertionoftheexonfromgene1intogene2.

转座子转座---外显子重组（混编）Exonshufflingbytranspositio

外显子混编（Exonshuffling）：产生许多新功能的蛋白质外显子混编是生物进化的一个重要过程，得益于真核生物DNA编码序列的组织方式：断裂基因含有长长的内含子，含有许多的重复序列，并处于外显子的两侧。因此，内含子的存在提供了外显子混编的基础。有人提出人基因组编码的约6万种蛋白质是从几千个独立的外显子混编而来。外显子混编（Exonshuffling第二节重组DNA技术重组DNA技术相关概念及意义重组DNA技术的原理及过程重组DNA技术与医学关系第二节重组DNA技术重组DNA技术相关概念及意义一、重组DNA技术相关概念及意义

（一）有关DNA克隆的相关概念克隆（clone）:通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体，这一群体可以是分子、细胞、动物或植物等。获取这一群体的过程称为克隆化（cloning）DNA克隆(DNAcloning)

：是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。又称分子克隆（molecularcloning)，基因克隆（genecloning）、重组DNA(recombinantDNA)

。一、重组DNA技术相关概念及意义（一）有关DNA克隆的相关重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)：是指实现基因（或DNA）克隆所采用的方法及技术路线等。又称基因工程（geneengineering），遗传工程（geneticengineering）等。重组DNA技术(recombinantDNAtechno（二）重组DNA技术的意义填平了物种间不可逾越的鸿沟；缩短进化时间；对生物定向改造；基因结构、结构功能及调控研究的基础；疾病诊治（二）重组DNA技术的意义填平了物种间不可逾越的鸿沟；二、重组DNA技术的原理及过程二、重组DNA技术的原理及过程基本过程：分切接转筛基本过程：分（一）工具酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录等有关的酶系统称为工具酶。（一）工具酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连常用的工具

酶

限制性内切核酸酶

(restrictionendonucleases)DNA连接酶

(DNAligase)DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)

多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)

反转录酶(reversetranscriptase)DNA末端转移酶(DNAterminaltransferase)

碱性磷酸酶

(alkalinephosphatase)在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体催化DNA切口平移反应，制备高比活探针；DNA末端标记，合成cDNA的第二链催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5’－OH末端上以RNA为模板合成互补的cDNA链线性双链或单链DNA分子的3’－OH末端加上同聚物尾去除DNA,RNA,dNTP的5’末端的磷酸基团工

具酶

主要功

能 常用的工具酶限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

定义：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶。分类I型：复合功能酶－内切(识别位点周围400-700bp)、甲基化、ATP酶和DNA解旋；III型：内切(识别位点周围25-30bp)、甲基化II型：识别和切割双链DNA的特异顺序(识别位点内)1、限制性核酸内切酶（restrictionendonuc命名：根据酶的微生物学名命名：如：Escherichiacoli,R株中几种限制酶：

EcoRI，EcoR

II，EcoR

V第一字母（大写，斜体），示该酶微生物属名；第二、三字母（小写，斜体），示该酶微生物种名；第四字母（大写，斜体），示该酶微生物株或型；如一种菌株中有多种限制性内切酶，用罗马数字表示发现分离的先后顺序。

命名：根据酶的微生物学名命名：

II型限制性内切酶的作用特点

识别序列４～６个碱基，4个核苷酸序列，则每４４（２５６）个碱基出现一个靶序列；6个核苷酸序列出现的间隔是4kb,8个核苷酸序列则是65kb。回文结构（palindrome）三种不同的切口：平末(bluntend)端、５’－突出粘性末端(cohensiveendorstick)３’－突出粘性末端II型限制性内切酶的作用特点限制性核酸内切酶三种切口

产生5′突出粘性末端（stickyend):以EcoRI为例：

5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI

3′---CTTAAOHPG---5′产生3′突出粘性末端:以PstI为例：

5′---CTGCAG---3′5′---CTGCAp

OHG---3′3′---GACGTC---5′

PstI3′---GOHpACGTC---5′产生平末端（bluntend):以NruI为例：

5′---TCGCGA---3′5′---TCGp

OHCGA---3′3′---AGCGCT---5′

NruI3′---AGCOHpGCT---5′限制性核酸内切酶三种切口产生5′突出粘性末端（stickyII型限制性内切酶的用途：

DNA克隆

DNA杂交与序列分析改建质粒构建基因组图谱和文库限制与修饰系统（restriction

–

modification

，R-M系统）：

甲基化酶与相关的II型限制性内切酶组成，它们识别相同序列，发挥不同功能。

如：EcoRIrestrictionendonuclease和EcoRImethylaseII型限制性内切酶的用途：restriction–modification(a)EcoRI,arestrictionenzymefromE.coli,makesstaggeredcutsatthespecific6-bpinvertedrepeatsequenceshown.Thiscleavageyieldsfragmentswithsingle-stranded,complementary“sticky”ends.Manyotherrestrictionenzymesalsoproducefragmentswithstickyends.(b)Bacterialcellswithrestrictionendonucleasesalsocontaincorrespondingmodificationenzymesthatmethylatebasesintherestriction-recognitionsite.Forexample,E.colicellscontainingtheEcoRIrestrictionenzymealsocontainEcoRImethylase,amodificationenzymethatcatalyzesadditionofamethylgrouptotwoadeninesintheEcoRIrecognitionsequence.ThemethylatedrestrictionsiteisnotcleavedbyEcoRI,assuringthatacellmakingthisrestrictionenzymedoesnotdestroyitsownDNA.restriction–modification(a2、DNA聚合酶（DNApolymerases）能合成DNA的酶称DNA聚合酶。常用的酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片断（Klenow片段）TaqDNA聚合酶反（逆）转录酶末端脱氧核糖核酶转移酶（末端转移酶）2、DNA聚合酶（DNApolymerases）能合成DN(1)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ5’3’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶枯草杆菌蛋白酶Klenow片段(1)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ5’3作用特点：多功能酶：5′→3′DNA聚合酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性主要用途:

催化DNA切口平移反应，制备高比活探针；DNA测序、合成cDNA第二链，及DNA末端标记（Klenow片段）作用特点：多功能酶：5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合酶I（全酶）利用大肠杆菌DNA聚合酶I进行切口平移法Mg2+dATPdCTPdGTPα-32PdTTPT*T*T*T*T*T*5’5’5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合酶I（全酶）利5’5’5’5’5’5’限制性内切酶Klenow片段α-32PdNTP变性3’末端32P标记的单链DNA探针利用Klenow片断进行3’端标记5’末端突出的DNA5’5’5’5’5’5’限制性内切酶Klenow片段变性3（2）TaqDNA聚合酶1988年saiki在嗜热水生菌(thermusaquaticus)分离出耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，MW=65kD，主要应用于聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）中对DNA分子的特定序列进行体外扩增（2）TaqDNA聚合酶1988年saiki在嗜热（3）反转录酶(reversetranscriptase)

亦称依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP)催化以RNA为模板的DNA聚合反应，以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(com-plementaryDNA)。主要用于cDNA文库的构建。3′→5′外切酶活性（又称RNA酶H活性），特异性降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分（3）反转录酶(reversetranscriptase（4）末端脱氧核糖核酸转移酶

（末端转移酶,terminaltransferase）催化作用：在二价阳离子存在下，它催化dNTP加到DNA分子的3′羟基端。用途：用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端；用于DNA片断3′-末端标记。（4）末端脱氧核糖核酸转移酶

（末端转移酶,terminaAAAA·····An3’mRNAAAAA·····An3’mRNATTTT5’cDNATTTT5’GGGGGGGGTTTT5’5’CCCCAAAAOligo(dT)引物反转录酶dNTPOligo(dC)引物Taq

DNA聚合物（或Klenow片段）dNTP去除mRNA链加oligo(dG)末端转移酶cDNA双链全长双链cDNA的合成5’5’3’3’3’3’AAAA·····An3’mRNAAAAA···3、DNA连接酶(ligase)催化两个独立DNA片段的5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键，使DNA片段拼接起来T4连接酶：粘性末端和平末端；大肠杆菌连接酶：粘性末端3、DNA连接酶(ligase)4、多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）寡核苷酸探针标记；用于连接反应，使缺少５’端磷酸的DNA片段合成接头磷酸化NNNNNHOAd-P-P-P5

3NNNNNP5

3+Ad-P-P+[-32P]ATPADP寡核苷酸片段32P标记的寡核苷酸片段多核苷酸激酶4、多核苷酸激酶（polynucleotidekinase（二）基因载体（vector）

载体（vector）：携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和/或表达的一类DNA分子。载体特征：自主复制即有复制原点（必需）酶切位点（必需）大小适合筛选标记:如抗药性、营养标记、

-半乳糖苷酶显色反应等拷贝数高（二）基因载体（vector）载体（vector）：携带载体类型：来源:质粒；噬菌体；病毒,酵母人工染色体功能:

克隆载型体和表达型载体受体细胞:

原核细胞载体、真核细胞载体和穿梭载体（shuttlevector）载体类型：质粒（plasmid）：细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒复制的类型：严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关松弛型：10-200拷贝以上常用载体：pBR322：4.36kb；人工构建；Tetr和Ampr；多克隆位点，松弛型pUC系列质粒：pBR322和M13噬菌体改建,2.674kb；Ampr；蓝白斑筛选（lacZ'，

-肽）；高拷贝（500-700）1、质粒载体

质粒（plasmid）：细菌染色体外小型双链环状DNA。1、用途：保存与扩增<2kb的目的基因构建cDNA文库测序制备探针用途：复制点：ori筛选标记：ampr,tetr克隆位点：多个单一限制性内切酶位点复制点：ori基因重组与基因工程概述课件2、噬菌体载体（bacterieophagevector）2、噬菌体载体（bacterieophag基因组特点：50kb双链DNA分子，末端12bp为互补单链（cos位点，又称粘端）两个启动子：PR和PL编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等生长方式：溶菌性生长（组装噬菌体）溶源性生长（整合入细菌DNA内）λ噬菌体载体（BacteriophageLambda）基因组特点：λ噬菌体载体（BacteriophageLamcosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及酶切割位点cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGCos序列及酶载体种类：插入载体（insertionvector）：外源性DNA直接插入酶切位点（EcoRⅠ）容量：几个kb代表载体：λgt10；λgt11用途：构建cDNA文库替代载体（substitutionvector）：外源性DNA替代载体中央部分酶切位点：EcoRⅠ；BamHⅠ；SalⅠ容量：9-22kb代表载体：EMBL4用途：构建基因组文库载体种类：coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoRIlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4

噬菌体插入载体和替代载体示意图coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoR3、柯斯质粒载体（cosmid）基因组组成：质粒与噬菌体的cos位点联合构成、4-6kb、质粒复制起始位点、酶切位点、抗药性基因；容量：29-45kb代表载体：pGEM-3Zf（-）工作方式：具有噬菌体样的包装和感染，又具有质粒样的复制用途：基因组文库3、柯斯质粒载体（cosmid）基因组组成：质粒与噬菌体的c基因重组与基因工程概述课件（三）目的基因（targetgene）1、目的基因的用途研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗研究生物种系进化与相关同源性基因工程重组表达改造某些基因，以改良品种基因治疗（三）目的基因（targetgene）1、目的基因的用途2、获得目的基因的方法

原核目的基因获得：直接分离真核目的基因获得：基因组文库筛选cDNA文库筛选人工合成PCR合成2、获得目的基因的方法

原核目的基因获得：直接分离DNA文库概念

DNA文库（DNAlibrary）：通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种重组DNA分子的集合体。分两类：基因组文库(genomiclibrary)：将某种生物细胞的基因组DNA切割成一定大小的片段后，分别与合适的载体重组并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存在宿主细胞内的整个基因组DNA片段集合体称~。cDNA文库(cDNAlibrary)：将分离纯化获得某种真核细胞中的全部mRNA逆转录成cDNA，并通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中。这种保存在宿主细胞内的cDNA集合体称~。DNA文库概念用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循环：变性（95oC）退火延伸（72oC）第二次循环3’5’5’3’3’5’5’3’第三次循环25~30次循环后模板DNA含量可以扩大100万百倍以上PCR原理模板DNA引物引物3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循环：用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因一对引物分别含有BamHI和HindIII位点，PCR产物经双酶切后，可定向插入载体。用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因一对引物分别含有Ba（四）外源基因与载体的连接作用酶：DNA连接酶连接方式：粘性末端连接平末端同聚物加尾连接人工接头

（四）外源基因与载体的连接作用酶：DNA连接酶基因重组与基因工程概述课件基因重组与基因工程概述课件人工接头连接法BamHI接头连接酶BamHI切割连接酶+BamHI切割的pBR322人工接头连接法BamHI接头连接酶BamHI切割连接酶+（五）重组DNA导入受体菌1、重组子导入受体菌的方式

：转化（transformation）：特指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）：病毒及其重组子导入受体细胞。（五）重组DNA导入受体菌1、重组子导入受体菌的方式：2、导入方法氯化钙法感受态

：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态

制备条件：冰浴、低渗CaCl2（

0.1mol/L）

转化反应：冰浴30分短暂热休克（42℃）

转化效率：105-106/µgDNA;环状DNA高于线状DNA1000倍电穿孔法：电穿孔仪2、导入方法氯化钙法（六）重组子的筛选与鉴定1、阳性菌落筛选：抗药性标志：ampr、tetr、neor插入抗性失活互补筛选：蓝白斑筛选（α-互补）、营养缺陷互补分子杂交：原位杂交、southern杂交（六）重组子的筛选与鉴定1、阳性菌落筛选：2、插入外源性DNA的鉴定：酶切（目的片段长度）PCR测序3、表达蛋白的鉴定：免疫学、生物学活性2、插入外源性DNA的鉴定：抗药性筛选抗药性筛选多克隆位点启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA

半乳糖苷酶N端编码序列pUC182686bppUC182686bp染色体重组体pUC18细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落含载体pUC18的蓝色菌落

半乳糖苷酶C端编码序列转化转化

利用互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子pUC18amprampr多克隆位点启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA半乳糖蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒原位杂交RadioactiveprobewillhybridizewithitscomplementaryDNAWashfilter,prepareautoradiographandcomparewithmasterplatePlacenitrocellulosefilterinsealableplasticbagwithsolutionoflabeledDNAprobe原位杂交RadioactiveprobewillhybSouthernblotSouthernblot免疫学方法筛选重组子免疫学方法筛选重组子DNA重组技术实例：

基因文库构建与筛选DNA重组技术实例：

人基因组文库构建

ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector.

人基因组DNA用限制性内切酶（Sau3A）部分消化产生约20-kb带粘性末端的部分重叠的随机片段；载体消化：噬菌体DNA用BamH1消化，去掉中间的可置换片段，并产生左右两个带粘性末端的片段基因组片段与噬菌体DNA拼接成重组DNA体外装配有活性的噬菌体，并感染大肠杆菌菌种培养、筛选、扩增保存InfectE.coliIndividualclones人基因组文库构建

ConstructionofagenProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.

Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4-bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsingle-strandedstickyendswiththissequenceonthe5’endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfrag