蛋白质生化技术实验报告

蛋白质生化实验报告生殖免疫研究所薛樱子学号：1133111003实验一溶液中蛋白质浓度的测定一光吸收法（测量范围：0.1—2mg）1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。

纯蛋白的A280/A260为1.8，纯核酸的A280/A260为2步骤：2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0。2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0。2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。2.5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。3结果与分析：A280=0.571A260=0.340根据公式：蛋白浓度=1.5×A280—0.75×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。二Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。2试剂：2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。当天使用。2.2）乙液：市售的Folin—酚试剂1：1稀释成乙液（1N）3操作:3.1）标准曲线的制作：取12支大试管，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6毫升标准蛋白质溶液（浓度为300ug/mlBSA）。用水补足到2.0毫升，各管蛋白浓度分别为0，15ug/ml，30ug/ml，60ug/ml，90ug/ml，120ug/ml，180ug/ml，240ug/ml，300ug/ml，3.2）然后每支试管取0.3ml加入1.5毫升试剂甲迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.15毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀于室温（20～25℃）放置30分钟。3.3）用蛋白浓度为0的管调零，650nm测各管的OD值。每个浓度的管至少测两次取它们的平均值。以A650为纵坐标，蛋白浓度为横坐标做标准曲线。4结果与分析由于我当时把甲液乙液搞混淆了，所以用后面的考马斯蓝梯度浓度的蛋白重新做了，结果如下。蛋白浓度ug／ml037.515304560A65000.0360.130.050.0910.1490.188将这七组上数据作图得到下表：分析图表去掉第二三个偏离直线的点，得到此方程Y=0.003X待测蛋白的A650是0.255带入上方程得到，此蛋白的浓度为293ug/ml。5注意事项5.1）加入甲液这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。5.2）甲液乙液不要弄混淆了5.3）由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。三考马斯蓝G—250法（测量范围：10-200ug/ml）1实验原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。2试剂2.1）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入88％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL于4℃保存。3操作步骤3.1）各取20ul，50ul，100ul，200ul，300ul，400ul标准蛋白液（500ug／ml），用蒸馏水或缓冲液稀释成1ml，各管蛋白浓度分别为10ug／ml，25ug／ml，50ug／ml，100ug／ml，150ug／ml，200ug／ml。3.2）各取0.1ml考马斯蓝液置于微量测定板的孔中，每孔加入10ul标准蛋白或经蒸馏水稀释的待测样品，并以两孔加入同体积的蒸馏水作为空白对照。3.3）震荡均匀，2min后测定A595。4结果处理与分析4.1）由1～6号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；

4.2）求样品管A595的平均值A595；4.3）由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)；

蛋白浓度ug／ml0102550100150200样品A5950.350.3360.3710.3950.4680.5260.6020.632分析图表得到蛋白浓度与吸光值之间的方程：Y=0.0013X+0.3353将我们的待测蛋白代入方程得到蛋白浓度为228.07ug／ml。样品在最开始稀释了3倍，因此此结果要乘以三，则得出的最终样品蛋白浓度为228.07×3=684.2ug／ml实验二FPLC系统的使用，柱效测定1FPLC的使用：开机→进入界面→检查报警设置→洗泵→排气泡→接柱→选流速→基线调零→打开记录→命名结果→开始实验→保存结果2装柱2.1）溶液过滤2.2）柱子底部排气，拧紧，反向进水约2cm高，关紧出口，接上装柱器2.3）混匀凝胶，倒出所需体积凝胶，倒进装柱器2.4）打开出口，连接仪器和装柱器，调至凝胶耐受的最大压力，恒速装柱2.5）柱子体积不变时，暂停，取下装柱器2.6）调节器排气，插入柱中，固定外罗口，调节柱头至凝胶2mm深处，拧紧2.7）按装柱压力继续压紧柱子，如出现空隙，再次调低柱头，至柱子体积不变，换液平衡3测柱效（编程，采用自动上样的方法）1％的丙酮上样500ul，流速1ml/min，观察峰形，用软件计算柱效。4注意事项

4.1）仪器管路维护：每次工作结束后，用超纯水冲洗管路，并用20％乙醇保存管路。

4.2）系统泵的维护：将系统泵的清洁管道放入20％乙醇清洁液中，并定期更换清洁液。

4.3）所有的缓冲液和样品必须用0.45um/0.22um的微孔过滤。5实验结果分析N=5.54（Ve/W1/2）2Ve：开始加样至峰值的洗脱体积（保留体积）；W1/2：即峰高度一半处的峰宽的洗脱体积HETP=L/N=柱高cm/5.54（Ve/W1/2）2100cmL：柱床高度（M）对称值As=b/a，As大于1，峰形拖尾，表示柱床过松；As小于1，峰形前伸，表示柱床过紧。离子交换层析及疏水层析，As一般在0.8与1.8之间，凝胶过滤层析，As一般在0.7与1.3之间。结果:根据这些公式以及计算方法测得柱效为811（N/m）。实验三蛋白质的脱盐冻干1凝胶过滤法：1.1实验原理凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。2脱盐柱手动操作方法2.1先用注射器推入5ml水洗柱2.2用注射器推入1.5ml样品2.3用注射器装5ml水到柱子上2.4用收集管接住出口，推1.5ml，收集样品2.5继续推入剩余的水，继续用注射器推入5到10ml水洗柱2.6用注射器推入5ml20%乙醇，封闭下口，移走注射器，再封闭上口3注意事项：每次拔注射器前都要用小盖堵住出口，每次接住注射器之前都要排走柱子上方的气泡，以保证柱子不进空气，不干柱。3透析法原理：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法3.1操作脱盐→浓缩脱盐：将透析袋一段用透析夹夹住，倒入样品，夹住另一端，查漏。置大烧杯中，加入蒸馏水，打开磁力搅拌，4小时换液一次，记录样品体积和加入蒸馏水量及体积，计算透析效率。浓缩：将透析袋一端用透析夹夹住，倒入样品，夹住另一端，查漏。置一容器中，用PEG20000（或凝胶等）埋住，定期观察剩余体积至满意。4浓缩冻干4.1操作步骤样品预冷→冷井预冷→打开冻干样品盖子，离心旋转→打开真空泵→浓缩后取出样品，关机，关电源。5实验结果分析无色素时：第一次是为无色素蛋白样品，第一次是从23.5ml开始加样，到50.5ml蛋白峰降到最低，统计计算出样品的量是51-23.8=27.2ml，同样第二次加样为105.5-78.5=27ml，没有色素时峰形较单一，可以直接统计出。有色素时：有色素的蛋白样品峰形，色素带和蛋白带连在一起，如果单纯根据峰的出现没有办法知道什么时候停止收样，这样就根据上图的蛋白量来进行。第一次加样从24.5m开始加样，根据蛋白体积是27ml可知，应该到51.5ml就停止收样，第二次从100.5ml开始收样，到127.5ml停止收样，第三次从200ml到227ml是第三次收的蛋白样，依次按照这个方法就可以正确收到目的蛋白。实验四金属螯合层析1实验原理:该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。2操作步骤：2.1蒸馏水洗柱，用0.5倍体积的0.1mol／LNicl上柱2.2蒸馏水洗回基线为02.3用5倍体积上样缓冲液平衡柱子2.4样品调PH、过滤、上样2.5上样缓冲液洗至基线回02.6用0.02mol／LPB+0.5mol／LNicl洗弱结合蛋白2.7柱子的再生2.8样品的进一步纯化3实验结果分析前面有穿透峰可能是杂蛋白，当咪唑的浓度达到50％时蛋白峰出现，收集该蛋白，到75％时又有蛋白峰出现，但根据经验该峰不是目的蛋白峰，到100％时的峰表示一些高盐结合的色素被洗脱下来。对收集的样品进行脱盐处理，验证目的蛋白，75％（样品1）和100％（样品2）的进行脱盐处理时，样品1蛋白峰后出盐，然后出色素峰，但样品2就没有蛋白峰出现，只在出盐后出现色素峰，证明样品1才是目的蛋白样品。实验五SDS和凝胶染色定量1实验原理：SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。由于十二烷基硫酸根带负电，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别从而将将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。2试剂配制2.1）10％分离胶配制（6ml）30％凝胶贮液330ul1.5mol/LTris-HCl,PH8.8250ulH2O250ul10％SDS60ul10％过硫酸铵35ulTEMED5ul2.2）4％浓缩胶的配制30％凝胶贮液330ul1.5mol/LTris-HCl,PH6.8625ulH2O1.5ml10％SDS25ul10％过硫酸铵15ulTEMED5ul2.3）样品溶解液的配制1.5mol/LTris-HCl,PH6.82.5ml10％SDS2ml甘油1mlH2O4.5ml溴酚蓝少许共10ml2.4）电泳液的配制Tris3g甘氨酸14.4gSDS1g加蒸馏水至1000ml（PH8.3）2.5）蛋白染色和