抗结核药物敏感性试验能力的评估

抗结核药物敏感性试验能力的评估

实验室质量控制已成为实验室质量管理中不可或缺的一部分，在保证实验室认证、能力改进、检验工作效率和可靠性方面发挥着非常重要的作用。由于当前耐药结核病的防治已成为一大难题,耐药结核病患者的发现、诊断与治疗需以抗结核药物敏感试验(以下简称药敏)为依据,而抗结核药敏试验所提供的检测结果是否正确至关重要。为提高和保证药敏试验质量和结果的可靠性。我室参加了中国疾病预防控制中心国家结核病参比室在全国省级疾病预防控制中心组织实施的抗结核药物药敏试验实验室间比对工作,通过比对,验证药敏试验检测数据,现将我室2008—2010年间分别参加的3次测试结果分析如下。1材料和方法1.1试验消毒每次测试,国家参比室均下发30株盲样菌株,由不同的耐药株和敏感株构成。1.2菌种的活化培养按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》,我们收到盲样菌株管后,将下发的含菌2mL罗氏培养基冻存管置37℃恒温箱孵育24h后,转种至改良罗氏培养基中,37℃生长2周,挑取肉眼可见菌落,磨制成菌悬液。1.3检测药物敏感的方法采用世界卫生组织推荐使用的比例法。1.3.1仪器与设备ThermoⅡ级生物安全柜,SartoriusBSA型分析天平,ZHN-4型蒸气恒温箱,上海跃进隔水式恒温培养箱,涡旋振荡器,天津合普接种环加热灭菌器。1.3.2试剂和材料二甲基甲酰胺试剂,10%吐温-80,麦氏标准比浊管,生理盐水,试管、磨菌管,药敏培养基,22SWG标准接种环。1.3.3烟、链霉素、乙胺丁醇、emb配制培养基,4种一线药物培养基内终浓度为:利福平(RFP,40μg/mL)、异烟肼(INH,0.2μg/mL)、链霉素(SM,4μg/mL)、乙胺丁醇(EMB,2μg/mL)。每批次含药培养基的制作,均根据国家参比室下发的药粉效价具体计算含药量。收到药粉后,除将RFP进行冷冻保存外,其他3种药物进行冷藏保存。1.3.4菌株的准备和接种(1)挑取培养物:灼烧并冷却接种环,在培养基表面的各个部位挑取适量菌落,放入加有吐温-80溶液的磨菌管,将磨菌棒插入磨菌管,旋转磨菌棒进行磨菌,磨至呈乳酪样。(2)配置1mg/mL菌悬液:磨完菌,向磨菌管内加入少许灭菌生理盐水混匀,待菌液静置后,用滴管将菌液吸到10mL大试管中,加入灭菌生理盐水进行稀释,将该菌液与1mg/mL麦氏标准比浊管进行比浊,肉眼观察,直至浑浊度基本一致,即为1mg/mL菌悬液。(3)配置10-2mg/mL和10-4mg/mL菌液:每株菌株准备2支5mL试管,每管先加入2mL生理盐水,用接种环挑取1环1mg/mL菌悬液加入至其中一支试管混匀得到10-2mg/mL菌液,再用接种环挑取2环10-2mg/mL菌悬液加入至另一支试管中混匀得到10-4mg/mL菌液。(4)接种:用接种环分别挑取10-2mg/mL和10-4mg/mL菌液,分别接种于按编号对应准备好的药敏培养基斜面上。接种完毕后,将药敏培养基放入恒温培养箱37℃培养,4周观察结果。1.4受试菌对该抗结核药耐药含药培养基上生长的菌落数除以对照培养基上生长的菌落数,若耐药百分比大于或等于1%,则认为受试菌对该抗结核药耐药。每批试验结束后,将试验结果报国家参比室,由国家参比室将我室结果与标准结果进行比较,反馈我室比对测试结果。1.5药敏试验的敏感性(1)药敏试验的敏感性:参加评估实验室检出真正耐药的能力,指检测实验室检出的耐药菌株占真正耐药菌株数百分比;(2)药敏试验的特异性:参加评估实验室检出真正敏感的能力,指检测实验室检出的敏感菌株占真正敏感菌株数百分比;(3)药敏试验的符合率:又称一致性,指与标准结果相比,检测实验室得出正确结果数与总试验菌株数的百分比,反映实验室整体检测能力。1.6评估指标按WHO要求,符合率INH及RFP至少应达到90.0%以上,SM和EMB至少应达到80%以上。1.7统计方法数据录入采用EXCEL,运用SPSS17.0统计软件行χ2检验。2结果2.1sm与emb检测3次比对结果显示,INH和RFP的敏感性结果均保持在100%;SM分别由87%、92%提高到100%,平均为93%;EMB由50%、63%提高到83%,平均为69%。4种药物之间敏感性差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。2.2sm与emb比例3次比对结果显示,RFP的特异性均保持在100%;INH的特异性分别为96%、100%和92%,平均为96%;SM分别由80%、94%提高到100%,平均为91%;EMB分别为100%、100%和96%,平均为99%。4种药物之间特异性差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。2.34sm与emb分别3次比对结果显示,RFP的符合率均保持在100%,INH的符合率分别为97%、100%和97%,平均为98%;SM分别由83%、93%提高到100%,平均为92%;EMB分别为97%、90%和93%,平均为93%。4种药物之间符合率均值差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。2.4耐药株和敏感株配比2008年下发的30株菌中,耐EMB和耐RFP的菌株分别只有2株。3年间合计下发90株菌,INH耐药株和敏感株配比为13∶17,SM耐药株和敏感株配比为1,EMB耐药株和敏感株配比为8∶37,RFP耐药株和敏感株配比为2∶7。见表4。2.5耐药株和敏感株的测定我们将3次比对试验的每一株菌的检测结果和国家参比室反馈的结果一一进行比较,对4种药物分别计算耐药株和敏感株,国家共计下发121株耐药菌,我们检出113株,耐药预期值为93%;下发239株敏感菌中我们检出232株,敏感预期值为97%。敏感预期值显著高于耐药预期值(P<0.01)。见表5。3药物敏感性检测由于实验室的检测过程复杂,每一个环节都存在一定的影响因素,为保证检测结果的准确性,及时发现存在的问题,提高检测效率,预防较大误差的发生,实验室常常实施质量控制工作,实验室质量控制又分为室内质量控制和室间质量控制两部分。室间质量控制常称为室间质量评价,它对参评实验室整体水平进行评估,衡量实验室的整体工作质量,并不是对某个实验人员的操作进行评价。长期以来,室间质量评价一直都是临床实验室和公共卫生实验室质量保证的重要组成部分。室间质量评价常通过实验室间比对来完成,按照实验室认证认可对实验室间比对的定义,实验室间比对是指按照预先规定的条件,由两个或多个实验室对相同或类似被测物品进行检测的组织、实施和评价的活动。在全国疾病预防控制体系结核病参比实验室网络中,由中国疾病预防控制中心国家结核病参比室,组织实施省级结核病参比实验室进行抗结核药物敏感试验实验室间比对工作。抗结核药物敏感试验方法有很多种,我国曾大力推广使用绝对浓度法,随着跨国之间的联系越来越密切,为与世界接轨,现全国疾病预防控制机构结核病实验室已全面使用世界卫生组织推荐的比例法检测结核分枝杆菌的药物敏感性。我省结核病参比实验室从2008年开始运用比例法检测结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,时间较短,因此在运用比例法检测抗结核药物敏感性的熟练度上尚存不足。常规的药敏实验室间比对能够显著地提高实验室的药敏试验的质量。3次比对,INH的敏感性均为100%,特异性平均为96%,符合率平均为98%;SM的敏感性平均为93%,特异性平均为91%,符合率平均为92%;EMB的敏感性平均为69%,特异性平均为99%,符合率平均为93%;RFP的敏感性、特异性、符合率均为100%。4种药物之间除敏感性差异有统计学意义(P<0.01)外,特异性和符合率差异无统计学意义(P>0.01)。我们发现,在4种一线抗结核药物的检测过程中,我室RFP和INH的稳定性好于SM和EMB,在不断试验的过程中,SM和EMB的敏感性检测结果也得到逐步提高。由于结核分枝杆菌生长缓慢,药敏试验的操作步骤繁杂,影响因素多,在常规的操作过程中,我们不断分析药敏试验的每一个操作步骤,从药品质量、药敏培养基的制作、培养基凝固温度的控制、菌液稀释时与标准比浊管的比较,标准接种环挑取菌量等环节做好室内质量控制,从而不断提高了药敏试验的质量,在大多操作环节得到控制的条件下,我们将重点放在了磨制菌悬液和菌液的挑取操作上。由于结核杆菌的菌落干燥、不易乳化,菌落是否被充分地磨散成单个细菌的操作,以及标准接种环挑取菌量的多少直接影响结果判断。比对结果显示,我室敏感预期值为97%,耐药预期值为93%,敏感的预期值高于耐药预期值,无论国际还是国内都存在这个问题,根本原因在于检测人员在操作中接种菌量过大所致。由于2008年国家下发的30株菌株中,只有2株耐EMB,我室只正确检出1株,因此,一旦有1株未检出,对敏感性的检测结果影响较大,占50%。由于同一株菌需对不同的药物耐药或敏感,因此,在选择菌株时,存在一定的困难,需全盘考虑对每种药物的耐药数、敏感数配比问题,否则会对检测结果产生较大影响。在总数定为30株的测试株中,如果耐药和敏感各占15株左右,1株出现检测错误,所占的权重较轻,这样才不会对敏感性、特异性、一致性造成较大影响。从3年下发的菌株中,我们可以看出INH、SM的耐药菌、敏感菌匹配较为合理。虽然我室每次比对检测结果符合