基于胱氨自组装膜的聚电解质吸附电针检测人血浆抗凝血酶

基于胱氨自组装膜的聚电解质吸附电针检测人血浆抗凝血酶

1种抗菌剂和膜的制备方法抗凝酶（at-ii）是人体血浆中的一个重要抗凝酶诱生物。如果人体血浆中的亚硝酸含量过高或低，则可能导致出血和血栓形成。AT-Ⅲ的检测对于许多疾病,如血友病、急性肝炎和心肌梗塞等有重要的诊断意义。但是,目前临床的检测方法,如散射比浊法、酶联免疫法和火箭电泳法等,大多操作繁琐或准确度不高,尚缺乏成熟的标准化方案。因此,研究一种灵敏、准确、简便和易于标准化的检测方法仍是一件很有价值的工作。压电免疫传感器是近年来发展较快的一种生物传感器。它具有质量响应的高灵敏性和免疫反应的高特异性,检测简便快速,数据输出实时,样品无需标记和纯化,方法易于标准化,已成为生物传感器领域的研究热点。自组装单分子膜(SAM)是一种新型有机超薄膜,它具有较高的稳定性、有序性和生物相容性,方便灵活的分子设计。聚电解质交替吸附法用于组装多层蛋白质膜已有报道。本文尝试在石英晶振的金电极表面先组装一层胱氨单分子膜,通过胱氨上质子化的氨基(-NH2)组装一层带负电荷的褐藻酸钠(AAS),再调节溶液的pH值使低于AT-Ⅲ抗体的等电点,以使抗体带正电荷,从而通过静电吸附作用将抗体固定于晶振表面,用以在3.5%聚乙二醇(PEG)的缓冲液中检测人血浆中AT-Ⅲ,取得了令人满意的结果。2实验部分2.1抗凝血酶及氨基酸类CN3165型高分辨记数器(石家庄无线电四厂);9MHz,AT切型镀金石英晶振(北京无线电器材厂),晶振的一面用O型橡胶圈和塑料片封闭,以使之单面触液。抗凝血酶Ⅲ抗血清(效价1∶40,卫生部上海生物制品研究所);人血浆抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ,33.50mg/dL,卫生部上海生物制品研究所);胱氨(分子式C4H12N2S2,ACROS公司);戊二醛(武汉有机合成化工厂);褐藻酸钠(AAS,兰开夏Avocado试剂研究有限公司);聚乙二醇(PEG,天津天泰精细化学品有限公司);牛血清白蛋白(BSA,中国医药公司北京采购供应站);人血清白蛋白(HSA,卫生部上海生物制品研究所);血浆蛋白成份参考血清(卫生部上海生物制品研究所);Piranha试剂(按7∶3配制的H2SO4和H2O2混合液);其它试剂均为分析纯;所用水为二次蒸馏水。2.2单分子所得税氨膜的组成将石英晶振洗净后,浸泡于0.2%的胱氨溶液中,在37℃的恒温箱内温育60min,取出水洗,吹干,即可完成胱氨单分子膜的自组装。2.3自组装聚电解质aas采用聚电解质吸附固定法,将组装了胱氨单分子膜的晶振置于0.25%AAS溶液中浸泡40min,可完成聚电解质AAS的自组装。采用戊二醛键合固定法,将组装了胱氨单分子膜的晶振置于2.5%的戊二醛溶液中浸泡60min,可完成戊二醛的修饰,用水冲洗,吹干。2.4修饰晶振的制备取AT-Ⅲ抗血清15μL,用pH值为5.0的PBS缓冲液稀释至30μL,分别滴加于修饰了AAS和戊二醛的晶振表面,于37℃的恒温箱内温育40min,取出,用PBS缓冲液冲洗,吹干,再滴加30μL浓度为10g/L的BSA于晶振表面,在37℃下温育40min,以封闭晶振上的非特异性活性位点,最后用PBS缓冲液冲洗,吹干。2.5at-浓度的测定将固定了AT-Ⅲ抗体的两种晶振,分别安装于盛有3.0mLKH2PO4-Na2HPO4缓冲液(PBS,pH7.0,0.9%NaCl,3.5%PEG)的检测池中,待仪器稳定后,注入待测人血浆AT-Ⅲ,记录免疫反应的响应频率至反应结束(约30min),由响应的频移值可得出AT-Ⅲ的浓度。2.6传感器再生每次测定完毕,滴加Piranha试剂于晶振表面反应5min,然后用水冲洗,重复操作2~3次后,吹干备用。3结果与讨论3.1抗虫活性分子的固定化3.1.1ph值对抗体固定的影响由于抗体一般是两性蛋白质,溶液的酸度对其带电性质和带电量均影响较大,晶振采用AAS吸附法固定抗体时,应使pH值低于其等电点以使之带正电,故必须严格控制溶液的pH值。实验考察了pH值对抗体固定的影响(如图1)。由图可知,适于抗体包被的溶液pH值范围为4.0~6.0,当pH值为5.0时,其包被量达到最大。3.1.2响应频移值的计算抗体溶液的稀释比的影响如图2所示。由图可看出,当抗体溶液的稀释比为1∶2时,晶振的响应频移值最大,超过此浓度后,响应的频移值略呈下降趋势。表明在一定的实验条件下,晶振表面供抗体包被的活性位点有限,抗体的浓度达到一定值后,膜上即达到包被饱和状态,此外,抗体的浓度太高,包被速度过快,导致抗体分子排列无序,空间位阻增大,不利于抗体的包被。3.1.3采用戊二醛键合固定时长结果表明,晶振采用AAS吸附固定时,其固定抗体的合适时间为40min,而采用戊二醛键合固定时为60min。可能是因为前者的固定是物理吸附作用,而后者是共价键合作用,尚需要一定的活化能,故后者的固定化速度较前者慢。3.1.4抗体包被温度考察了不同温育温度对抗体包被的影响。发现适于抗体包被的温度范围为21℃~44℃。温度过低,抗体的包被速度慢,固定化效率低;温度过高,晶振固定抗体的量减少且不稳定,并易使抗体分子失活。3.1.5l/l图3是离子强度的影响情况。由图可知,当溶液中NaCl的浓度大于20mmol/L时,对抗体的包被影响明显。可能是因为离子强度过大,会屏蔽膜表面及抗体所带的电荷或引起其静电键的断裂,对抗体的吸附固定不利。3.2晶振测定hsa在PBS缓冲液(pH7.0,0.9%NaCl,3.5%PEG)中,考察了两种晶振测定AT-Ⅲ(1.792mg/L)时反应的频率响应特征(如图4)。由图可看出,免疫反应的发生使响应频率开始降低得很快,随后渐慢,反应进行到30min后,响应的频率均基本上不再变化,表明此时反应已达到平衡状态(曲线2与3)。晶振测定HSA(2.902mg/L)时(曲线1),开始因非特异性吸附出现一个频率突降,然后(约5min)即趋于稳定。由图可知,在同一条件下,晶振采用AAS吸附法固定抗体(曲线3),其反应响应的频移值较采用戊二醛键合法(曲线2)大,表明前者固定的抗体的反应活性较后者高。3.3线性浓度和检出限在上述优化的实验条件下,考察了两种传感器的主要响应特性。分别测定了一系列不同浓度的人血浆AT-Ⅲ(CAg),得到其响应的频移值(ΔF),绘制出ΔF~CAg校正曲线(图5)。由图可知,在以3.5%PEG作免疫反应促进剂的条件下,采用AAS吸附法时(曲线1),检测AT-Ⅲ的线性浓度范围为0.075~2.240mg/L,灵敏度为150.6Hz/(mg/L),检出下限为0.045mg/L。采用戊二醛键合法时(曲线2),线性浓度范围为0.224~1.792mg/L,灵敏度为116.0Hz/(mg/L);检出下限为0.112mg/L。可见,采用AAS吸附固定法检测AT-Ⅲ,其线性浓度范围较采用戊二醛键合固定法宽。这是因为前者以静电吸附作用固定的抗体分子能保持原有的分子结构,且分子尚能自由转动,活性位点受损较少;而后者以共价键合作用固定的抗体分子不能自由转动,部分活性位点被键合,影响了其反应性能。此外,传感器以3.5%PEG作反应的促进剂,明显地放大了反应的响应频移(见表1),使晶振的检测灵敏度与检测限得到了相应改善。3.4晶振再生性能免疫传感器的再生性是决定其实用性的关键因素之一。通常,要使传感器能重复使用,需采用适当的方法将Ab-Ag复合物从传感器表面脱附,或者将Ab-Ag键离解以使抗体或抗原解吸。裴仁军等考察了4种用于Ab-Ag键解离的解吸剂,认为均较难使晶振再生完全,再生性能远不及强酸碱加超声清洗法佳,但晶片电极采用强酸碱加超声清洗法再生后,只能重复使用约10次。表明该清洗法对镀金晶振损伤较大。本实验采用Piranha试剂作洗脱液,通过强酸与强氧化剂的配合作用,促使蛋白迅速变性并从金电极表面脱落,可较好地实现传感器的再生。测定晶振再生后的气相频率值,并与实验前比较,发现前后的频率差值仅为±12Hz。晶振经连续使用100余次,其灵敏度仍达90%以上。因此,以Piranha试剂作洗脱液的再生法,不仅具有快速、简便和再生完全等优点,而且对镀金晶振的损伤小,是一种适于镀金晶振再生的有效方法。3.5回收率的测定分别用2.902mg/L的HSA和BSA溶液代替AT-Ⅲ进行测定,测得二者因非特异性吸附引起的响应频移值分别为33Hz和27Hz,明显低于传感器的检测下限所对应的频移值(51Hz)。对浓度为1.120