人胸苷激酶单克隆抗体的制备及体外免疫反应研究

人胸苷激酶单克隆抗体的制备及体外免疫反应研究

人类真核细胞（htk）存在。这是dna合成过程中的一个重要激酶，与细胞的分离和复制密切相关。hTK有两种主要同工酶,TK1存在于细胞质,而TK2存在于线粒体。研究表明,hTK的升高或减低与肿瘤的发生、发展、转移有密切关系。目前定量检测体液中的hTK尚无一个满意的方法,研究新型的传感检测技术对于hTK的临床检测有重要意义。先前的工作中,我们用DNA重组技术克隆了hTK基因,且在大肠杆菌中得到了高效表达,重组表达的hTK用于免疫小鼠制备单克隆抗体。本文在研究了用于hTK检测的压电免疫传感器的基础上,对所制备抗体与hTK的免疫反应进行更加深入的研究,计算出该抗原抗体反应的亲和常数,为进一步将该抗体用于hTK的临床检测奠定基础。1材料和方法1.1实验材料和方法CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电器厂);石英晶振,AT切割(JA5型),9MHz,两面镀金电极,晶片直径12mm,电极直径6mm,振荡电路为本室自制TTL电路。恒温箱(上海实验仪器厂有限公司),蛋白A(北京本元青阳生物科技发展有限公司),使用时用磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)配制成1mg/ml溶液,实验所用水均为二次蒸馏水。hTK抗原、抗hTK单克隆抗体由本实验室制备,方法已另文报道。1.2组装法ws先将压电石英晶振用新配制的piranha溶液(3/1浓H2SO4/H2O2)洗涤10min,滴加1mg/ml的蛋白A10μl于金电极上,室温下自组装30min,蒸馏水冲洗,磁力搅拌器搅拌下在含0.9%NaCl的PBS中洗5min。蒸馏水冲洗并用氮气吹干,滴加1mg/ml抗体10μl,于37℃恒温箱中反应60min,重复固定蛋白A后的洗涤过程,吹干备用。1.3htk引起的频移值将固定了蛋白A和抗体的晶振置于检测池中(单面与液体接触),加入180μlPBS,稳定后记录频率F1,用微量注射器注入20μl一定浓度的hTK,稳定后记录频率F2,得到该浓度hTK引起的频移值ΔF(F2-F1)。2结果2.1蛋白a引起的频移值蛋白A分子能与金形成非常稳定的蛋白A-金复合物,亲和常数达108mol/L,在金电极上有强烈吸附现象。因此通过自组装的方法,蛋白A可在金电极表面形成一层牢固的蛋白A分子层,修饰后的传感器稳定性及重现性较好。蛋白A在金电极上成膜好坏与自组装时间长短有直接关系,我们测定了不同固定时间下蛋白A所引起的频移值,见表1。由表1可知,自组装超过20min,晶振频移值不再随固定时间的增加而明显增加,考虑到实验中有较多的洗涤步骤,为保证蛋白A与金电极的充分结合而不易被洗脱,实验中固定时间为30min。2.2抗a固定抗体抗体的Fc端能与固定在金电极上的蛋白A特异性结合,这种结合能使抗体的活性结合位点所在的Fab段能裸露在修饰膜的外层而伸向流动相,从而不影响抗体与抗原的反应活性。这种蛋白A固定的抗体具有几何定向优势,使石英晶振表面有更多的抗原结合位点,能结合更多的待测抗原。固定抗体的浓度直接影响晶振表面的抗体的固定量,进而影响传感器的灵敏度,我们考察了固定抗体的浓度对抗体固定量的影响,表2是不同浓度的抗体在37℃恒温箱中反应60min所引起的频移值。从表2中可以看出,在较小浓度时,抗体固定量随浓度的增加而明显增大,当抗体浓度大于1mg/ml时,频移值趋于平稳,抗体固定量增加很小。可以认为此时抗体固定量已达最大,再增加抗体浓度已无意义,因此实验中采用1mg/ml的抗体。2.3浓度chtk的关系曲线将固定了抗体的传感器分别置于一系列不同浓度的hTK溶液中,测量其频移值,得到频移值(△F)对hTK浓度(ChTK)的关系曲线(图1)。图1显示,在较稀浓度时,石英晶体谐振器的频率变化值随着hTK浓度的增大而迅速增大,当hTK浓度大于40μg/ml时,随着hTK浓度的增大,晶振频率不再有明显变化,这可能是由于空间位阻或者抗体的活性位点达到饱和的缘故,hTK不能再通过免疫反应结合到晶振上。2.4结合确定抗体最佳配合比及分子数之比抗原抗体免疫反应结合常数的测量方法,通常是在抗原抗体浓度恒定或其变化条件已知情况下准确测定游离和结合形式的抗原(抗体)浓度。实验结果一般用质量作用定律推导出的标准Scatchard绘图法进行分析。对于免疫反应可用如下平衡式表示:Ag+Ab→KαAg−AbAg+Ab→ΚαAg-Ab设A为总的抗原浓度(mol/L),s为抗原的价,sA为总抗原结合位点总数(mol/L),B为总的固定抗体浓度(mol/L),n为抗体的价,nB为抗体结合位点总数(mol/L),x为结合抗原的浓度(mol/L)。免疫反应平衡时:游离抗原结合位点(mol/L)=sA-sx游离抗体结合位点(mol/L)=nB-sx根据质量作用定律,可得Kα=sx/(sA-sx)(nB-sx)(1)令f=x/B,d=A-x则(1)可变换为f/d=Kα(n-sf)(2)为便于Kα的测定,把(2)式改写为:1/f=1/nKα·1/d+s/n(3)在抗原抗体反应平衡常数的测量中,可用频移值来表征石英晶体表面固定抗体的质量和免疫反应后结合抗原的质量。再根据抗原抗体分子量,可得到固定抗体与免疫反应结合抗原的分子数之比(即摩尔比)。本实验中:d=A-x(4)f=x/B=△FAg/△FAb·MAb/MAg(5)考虑到这种免疫分析中,当抗原浓度较大时,通过免疫反应结合到晶阵表面的抗原相对于溶液中抗原的总量是比较小的,因而可以忽略免疫反应对溶液中抗原总浓度的影响,把d值近似为A值;抗原分子量为30000,抗体分子量为150000,固定抗体引起的频移值约为300。应用实验数据,以1/f对1/d作图,可得一条高度相关的直线,见图2。直线斜率为1/nKα,截距为s/n,由此可求得免疫反应结合常数Kα。对直线进行线性回归,可得直线方程斜率为4.73×10-7,截距为0.88,本实验中,溶液中的hTK作为自由抗原,可将其价数视为1,即s=1,根据截距,可算出抗体的价数,n=s/0.88=1.14。由于斜率1/nKα等于4.73×10-7,因而Kα=1/(1.14×4.73×10-7)=1.85×106(mol/L)3制备物的质量控制免疫亲和常数是确定单克隆抗体性质的重要参数之一,它表示抗原抗体结合的紧密程度,反映了抗体与抗原分子的一个决定簇起反应的能力,是评价抗体活性的重要指标。测定单克隆抗体的亲和常数有许多方法,经典的测定抗体亲和常数的方法是20世纪50年代左右发展起来的平衡透析法。该法的全部抗原抗体反应过程在均一液相体系中完成,反应的动力学过程受到的干扰因素较少,基本上完全符合质量作用定律的前提条件要求。但该法仅能测定小分子抗原与相应抗体间的亲和常数,同时要求将反应底物进行放射性标记,反应完成后又需将抗原抗体复合物与游离抗原抗体分开,实验过程繁琐、复杂。随着压电石英晶体液相振荡的实现,其具有高灵敏的质量响应(1Hz/ng)、对反应体系实时采样、进行连续监测的优点,已用于免疫反应过程的在线检测和免疫反应动力学的研究。本实验将蛋白A吸附于压电