蛋白质的Wesrern印迹分析

蛋白质的Western印迹分析一、原理

一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。原理：WesternBlotting是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。

二、方法样品蛋白的制备SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳转膜检测三、样品蛋白的制备1、原理：蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。三、样品蛋白的制备

2、蛋白质制备的步骤（1）选择材料和预处理（2）细胞的破碎及细胞的分离（3）提取和纯化（4）浓缩、干燥和保存三、样品蛋白的制备3、培养细胞中蛋白质样品的提取

提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。三、样品蛋白的制备3.1实验材料（1）器材：冷冻离心机，细胞刮，Tip头、1.5ml、0.5ml灭菌Ep管，碎冰。（2）试剂：①细胞总蛋白裂解液（100ml）:1×PBS80ml，Triton-1001ml,去氧胆酸钠0.5g,SDS0.1g,补1×PBS缓冲液至100ml。②PMSF贮存液（PMSF17.4mg/异丙醇）：PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。（3）Hela细胞

三、样品蛋白的制备3.2实验方法（1）洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37℃取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS洗细胞表面3～4次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。（2）向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。（3）冰浴30～60min，期间晃动3～4次。（4）用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5mlEp管中，4℃离心，12000g20min.（5）小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80℃保有存备用（可保存1年）三、样品蛋白的制备3.3注意事项（1）注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。（2）设立必要实验对照。（3）为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。（4）所用离心机需要提前预冷。（5）可于显微镜下观察细胸裂解的程度。（6）吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。三、样品蛋白的制备4、蛋白质的浓度测定——考马斯亮蓝蛋白定量法考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。4.1原理考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。三、样品蛋白的制备4.2实验材料（1）器材：分光光度计及玻璃比色皿（2）试剂：①0.5%mg/mlBSA标准蛋白液：生理盐水配制，分装小管，4℃保存。②考马斯亮蓝G-250母液：称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml浓磷酸(W/V)。过滤，4℃保存6个月。③考马斯亮蓝G-250使用液（0.01%考马斯亮蓝G-250）：取考马斯亮蓝G-250母液15ml，加蒸馏水稀释至85ml，临用前稀释。三、样品蛋白的制备4.3实验方法（1）稀释BSA标准品及制作标准曲线：用生理盐水将0.5mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液稀释成0,1,2,4,8,10,12ug/100ul（2）上述每管中分别加入1.5ml考马斯亮蓝G-250使用液，室温反应后测定595nm吸光度值(OD595)，依据所得数据制作标准曲线。（3）稀释待测蛋白样品：吸取细胞总蛋白样品2ul，加入98ul水（总体积为100ul）和1.5ml考马斯亮蓝使用液，混匀后室温反应3～5min，测定OD595。（4）计算样品总蛋白含量(ug/ul)：根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，并计算出蛋白含量。三、样品蛋白的制备4.4注意事项（1）制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做。（2）如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释倍后测定；如样品浓度底，可适当增加样品体积及减少水的体积。（3）比色皿的清洁：由于测定液中含有考马斯亮蓝，使用过的比色皿呈蓝色并蓝色不易被清水冲洗掉，需用无水乙醇先将比色皿脱色皿脱色数分钟，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗干净。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉1、原理

各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同面有不同的迁移率。如果在电泳体系加入SDS，形成带负电荷长椭圆棒状的蛋白质-SDS复合物。从而消除蛋白质原有的电荷和形体差异，从而对蛋白质进行分离。当对蛋白质样品做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉分析时，要在样品中加入含有SDS和B-巯基乙醇的样品处理液。样品处理液中加入溴酚蓝染料，用于控制电泳的过程。另外在样品液中加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时，使样品溶液可以沉入样品凹槽底部。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉

SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺：丙烯酰胺为了1：29配制，实验表明它能分离大小相差只有3%的多肽。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉成功的关键之一是电泳过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：（1）溶液中SDS单体的浓度SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度、温度和离子强度有关。（2）样品缓冲液的离子强度SDS的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100mmol/L(3)二硫键是否完全被还原只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上，使蛋白质的相对迁移率和分子量的对数呈线性关系。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉2、实验2.1实验材料（1）器材：垂直电泳槽，稳压稳流电泳仪/电转仪，蛋白变性用加热仪器，Tip头，Ep管，碎冰，注射器等。（2）1.0mol/LTip·HCl(PH6.8)。(3)1.5mol/LTip·HCl(PH8.8)。(4)10%SDS室温保存：去离子水配制。（5）10%过硫酸铵（保存）：提供驱动丙酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉（6）TEMED（N，N，N，N’-四甲基乙二胺）：催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。（7）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（1000ml）：去离子水500ml，Tris碱15.1g，甘氨酸94g,10%(W/V)电泳级SDS50ml，补去离子水至1000ml。使用前做5×稀释（8）4×蛋白质电泳上样缓冲液（9）蛋白质预染Marker四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉2.1实验方法1、制备SDS凝胶（1）准备SDS凝胶电泳用玻璃板夹板（2）配制10%SDS分离胶（15ml）(3)灌制分离胶（4）立即用0.1%SDS液覆盖胶面（隔绝空气有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），室温放置约40min至分离胶凝固。（5）配制5%浓缩胶4ml(可以与配制分离胶时同时进行)四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉（6）倒掉（吸附）0.1%SDS覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3～4次，以洗净未聚合的丙烯酰胺（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。（7）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%积层胶液（注意避免产生汽泡），插入样品梳，使液面至样品梳上标志位置，室温凝胶约40min.(8)轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明带，将玻璃夹板“凹”面紧贴紧电泳槽，两侧用夹子很好地固定在电泳槽上。用针头式注射注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去除未聚合的凝胶，待上电泳。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉2、样品变性及电泳（1）由-80℃冰箱取出Hela细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）待其融化。（2）吸取细胞总蛋白样品15ul加入0.5ulEP管中，每样品管中分别加入5ul4×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，98℃变性8min（同时变性标准分子量Marker），立即插入冰中，涡旋数秒，短暂离心。（3）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加入凝胶孔中。（4）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至100V使样品通过浓缩胶（电压约8V/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调高到130V（约15V/cm）,继续电泳使染料至分离胶适当位置（4℃冰箱中进行电泳），结束电泳。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉注意事项：（1）设立必要的蛋白质分子量标志物。（2）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量时应带手套及口罩。（3）不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议认准使用某一试剂级别。（4）一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。（5）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制。（6）为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4×蛋白质电泳液。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉（7）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下），经保证电荷由负极向正极流动。（8）凝胶玻璃板要定期做硅化处理：用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于180℃烘烤2h。五、转膜凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及二级免疫试剂对其进行孵育、检测。用于印迹法的固相支持物有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜及PVDF膜较为常用。下面是介绍PVDF（聚偏氟乙烯）膜作为固相支持物。转膜的方式有湿转和半干转，下面介绍的湿转方法。五、转膜1、实验材料（1）器材：转移电泳仪，转仪电泳槽，PVDF膜，剪刀，滤纸等。（2）试剂：①转移缓冲液：Tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O至1000ml，每次配完可用2～3次。最好现配现用。4℃避光保存。②考马斯亮蓝染色液（100ml）：考马斯亮蓝R-2500.25g，甲醇50ml，乙酸10ml，蒸留水40ml。待考马斯亮蓝R-250溶解，用Whatman1号滤纸过滤，以去除颗粒状物质。③脱色液：乙酸10%(V/V)，甲醇50%(V/V)，H2O40%。五、转膜2、实验方法（1）PDVF膜及滤纸的预处理：剪裁与胶大小一致的PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡10s（快速激活PDVF膜），去离子水处理5min，1×转移缓冲液处理10min以上。（2）剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移液缓冲液浸泡后待用。（3）取下电泳板，将其平置（使凹面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶在蒸馏水及1转膜液中各漂洗一次。五、转膜（4）转膜：①将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由正极侧开始，依次为海绵垫片→3层滤纸→PVDF膜→样品胶→三层滤纸（排除气泡）→海棉垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。②正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80V转膜2h（此操作在4℃冰箱中进行）③小心取出转移膜（用铅笔轻轻描出蛋白Marker带），在1×TBST液中漂洗两次。④将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，检查蛋白转移是否完全。五、转膜注意事项：（1）开始转移时一定要检查电流大小。过高电流产生的热量会导致转移失败，通常高电流是由于转移液配制不当造成的。（2）低离子强度转移缓冲液可使用较高电压，而不会导致高电流和过热，但转移过程中由凝胶中渗出的电解质可导致转移缓冲液电导增加，缓冲能力降低。（3）也可在恒流状态下以200mA转移2h。（4）若转移中因凝胶变形发生条带扭曲或由于凝胶中电解质渗出导致过热，可预先将凝胶在转移缓冲液中浸泡。五、转膜（5）使用预先染色的蛋白质分子量标准品或转移后将凝胶染色，可检查转移是否彻底。（6）对于较大蛋白质，较低的丙烯酰胺浓度可获得较好的转移效果。（7）对电转移来说，最常遇到的问题是目的蛋白质转移效率低，转移效率可由转移后对凝胶或膜染色来进行观察。六、检测1、实验器材（1）器材：摇床，避光盒，洗膜用平皿，X线片，X线片曝光盒等。（2）试剂：①10×TBST缓冲液：100mmol/LTris·HCl(pH8.0)，1500mmol/LNaCl，0.2%Tween-20，补水至1000ml，高压灭菌，4℃保存，使用前稀释10倍。②5%脱脂奶粉（1×TBST配制）。③一抗：羊抗Actin(使用前用1×TBST稀释200倍)。④二抗：兔抗羊IgG/HRP(使用前用1×TBST稀释2000倍)。⑤ECL试剂盒。六、检测2、实验方法（1）封闭：将转移后的膜放入5%（W/V）脱脂奶粉中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h(或4℃过夜)（2）一抗反应：①将一抗（羊抗Actin）用1×TBST稀释200倍)；②将封闭后的膜直接放入上述抗体中，4℃反应过夜。（3）洗膜：将反应膜放入平皿中，用1×TBST漂洗一次，继而用1×TBST洗涤3次（室温下缓慢摇动洗涤）以洗净未结合的一抗，每次换入新液洗涤10min。（4）二抗反应：①将二抗（兔抗羊IgG/HRP）用1×TBST稀释2000倍；②将经一抗作用过的膜放入上述二抗液体中（室温、避光缓慢摇动）作用50min(不超过60min).(5)洗膜：用1×TBST洗膜，方法同（3），洗去二抗。六、检测（6）曝光及洗片：①按1:1（V/V）混合ECL试剂盒中两种液体，在辣根过氧化物酶（HRP）催化下，过氧化物酶与Luminol增剂反应发强光，可见信号可以用压片法检测。Western实验中，HRP标记在二抗上，与一抗靶蛋白复合物结合，再用底物进行发光检测。②将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用2min，抖掉膜上液体，将膜用保鲜膜包裹（避免在膜的上面出现气泡）③在暗室中（红光下），将X线胶片直接压于包裹后的膜上，曝光适当时间。④将曝光后X光线片在清水盘中浸湿→显影液中显影→清水中漂洗→定影液中定影5min（具体曝光时间及显影时间需根据显影结果作出调整）。六、检测注意事项：（1）选择合适的一抗及二抗浓度。（2）选择合适的封闭液。（3）吸取ECL试剂时要注意更换Tip尖。两种试剂一经混合，应在内使用。（4）注意避光操作。（5）应考滤ECL试剂的发光强度极其衰灭时间，因此请按说明书及实验具体情况进行。请批评指证

谢谢第一节活塞式空压机的工作原理第二节活塞式空压机的结构和自动控制第三节活塞式空压机的管理复习思考题单击此处输入你的副标题，文字是您思想的提炼，为了最终演示发布的良好效果，请尽量言简意赅的阐述观点。第六章活塞式空气压缩机

piston-aircompressor压缩空气在船舶上的应用：

1.主机的启动、换向；

2.辅机的启动；

3.为气动装置提供气源；

4.为气动工具提供气源；

5.吹洗零部件和滤器。

排气量:单位时间内所排送的相当第一级吸气状态的空气体积。单位：m3/s、m3/min、m3/h第六章活塞式空气压缩机

piston-aircompressor空压机分类：按排气压力分：低压0.2～1.0MPa；中压1～10MPa；高压10～100MPa。按排气量分：微型<1m3/min；小型1～10m3/min；中型10～100m3/min；大型>100m3/min。第六章活塞式空气压缩机

piston-aircompressor第一节活塞式空压机的工作原理容积式压缩机按结构分为两大类：往复式与旋转式两级活塞式压缩机单级活塞压缩机活塞式压缩机膜片式压缩机旋转叶片式压缩机最长的使用寿命-

低转速（1460RPM），动件少（轴承与滑片），润滑油在机件间形成保护膜，防止磨损及泄漏，使空压机能够安静有效运作；平时有按规定做例行保养的JAGUAR滑片式空压机，至今使用十万小时以上，依然完好如初，按十万小时相当于每日以十小时运作计算，可长达33年之久。因此，将滑片式空压机比喻为一部终身机器实不为过。滑(叶)片式空压机可以365天连续运转并保证60000小时以上安全运转的空气压缩机1.进气2.开始压缩3.压缩中4.排气1.转子及机壳间成为压缩空间，当转子开始转动时，空气由机体进气端进入。2.转子转动使被吸入的空气转至机壳与转子间气密范围，同时停止进气。3.转子不断转动，气密范围变小，空气被压缩。4.被压缩的空气压力升高达到额定的压力后由排气端排出进入油气分离器内。4.被压缩的空气压力升高达到额定的压力后由排气端排出进入油气分离器内。1.进气2.开始压缩3.压缩中4.排气1.凸凹转子及机壳间成为压缩空间，当转子开始转动时，空气由机体进气端进入。2.转子转动使被吸入的空气转至机壳与转子间气密范围，同时停止进气。3.转子不断转动，气密范围变小，空气被压缩。螺杆式气体压缩机是世界上最先进、紧凑型、坚实、运行平稳，噪音低，是值得信赖的气体压缩机。螺杆式压缩机气路系统：

A

进气过滤器

B

空气进气阀

C

压缩机主机

D

单向阀

E

空气/油分离器

F

最小压力阀

G

后冷却器

H

带自动疏水器的水分离器油路系统：

J

油箱

K

恒温旁通阀

L

油冷却器

M

油过滤器

N

回油阀

O

断油阀冷冻系统：

P

冷冻压缩机

Q

冷凝器

R

热交换器

S

旁通系统

T

空气出口过滤器螺杆式压缩机涡旋式压缩机

涡旋式压缩机是20世纪90年代末期开发并问世的高科技压缩机，由于结构简单、零件少、效率高、可靠性好，尤其是其低噪声、长寿命等诸方面大大优于其它型式的压缩机，已经得到压缩机行业的关注和公认。被誉为“环保型压缩机”。由于涡旋式压缩机的独特设计，使其成为当今世界最节能压缩机。涡旋式压缩机主要运动件涡卷付，只有磨合没有磨损，因而寿命更长，被誉为免维修压缩机。

由于涡旋式压缩机运行平稳、振动小、工作环境安静，又被誉为“超静压缩机”。

涡旋式压缩机零部件少，只有四个运动部件,压缩机工作腔由相运动涡卷付形成多个相互封闭的镰形工作腔，当动涡卷作平动运动时，使镰形工作腔由大变小而达到压缩和排出压缩空气的目的。活塞式空气压缩机的外形第一节活塞式空压机的工作原理一、理论工作循环（单级压缩）工作循环：4—1—2—34—1吸气过程

1—2压缩过程

2—3排气过程第一节活塞式空压机的工作原理一、理论工作循环（单级压缩）

压缩分类：绝热压缩：1—2耗功最大等温压缩：1—2''耗功最小多变压缩：1—2'耗功居中功＝P×V（PV图上的面积）加强对气缸的冷却，省功、对气缸润滑有益。二、实际工作循环（单级压缩）1.不存在假设条件2.与理论循环不同的原因：1）余隙容积Vc的影响Vc不利的影响—残存的气体在活塞回行时，发生膨胀，使实际吸气行程（容积）减小。Vc有利的好处—

（1）形成气垫，利于活塞回行；（2）避免“液击”（空气结露）；（3）避免活塞、连杆热膨胀，松动发生相撞。第一节活塞式空压机的工作原理表征Vc的参数—相对容积C、容积系数λv合适的C：低压0.07-0.12

中压0.09-0.14

高压0.11-0.16

λv＝0.65—0.901）余隙容积Vc的影响C越大或压力比越高，则λv越小。保证Vc正常的措施：余隙高度见表6-1压铅法—保证要求的气缸垫厚度2.与理论循环不同的原因：二、实际工作循环（单级压缩）第一节活塞式空压机的工作原理2）进排气阀及流道阻力的影响吸气过程压力损失使排气量减少程度，用压力系数λp表示：保证措施：合适的气阀升程及弹簧弹力、管路圆滑畅通、滤器干净。λp

（0.90-0.98）2.与理论循环不同的原因：二、实际工作循环（单级压缩）第一节活塞式空压机的工作原理3）吸气预热的影响由于压缩过程中机件吸热，所以在吸气过程中，机件放热使吸入的气体温度升高，使吸气的比容减小，造成吸气量下降。预热损失用温度系数λt来衡量（0.90-0.95）。保证措施：加强对气缸、气缸盖的冷却，防止水垢和油污的形成。2.与理论循环不同的原因：二、实际工作循环（单级压缩）第一节活塞式空压机的工作原理4）漏泄的影响内漏：排气阀（回漏）；外漏：吸气阀、活塞环、气缸垫。漏泄损失用气密系数λl来衡量（0.90-0.98）。保证措施：气阀的严密闭合，气缸与活塞、气缸与缸盖等部件的严密配合。5）气体流动惯性的影响当吸气管中的气流惯性方向与活塞吸气行程相反时，造成气缸压力较低，气体比容增大，吸气量下降。保证措施：合理的设计进气管长度，不得随意增减进气管的长度，保证滤器的清洁。2.与理论循环不同的原因：二、实际工作循环（单级压缩）第一节活塞式空压机的工作原理上述五条原因使实际与理论循环不同。4）