离体培养法培养曼陀罗毛状根中东碱和碱的含量

离体培养法培养曼陀罗毛状根中东碱和碱的含量

梅莉亚甲基酯（mj）是一种由素木兰花中的有香味化合物，也是茉莉花中独特的香料，在其他植物中也广泛分布。研究发现它在植物细胞的多种逆境反应中起信号介导的作用,引起细胞抗逆反应产物的表达,并能作为诱导子(elicitors)诱导曼陀罗、丹参等物种毛状根中次生代谢产物的积累和释放。曼陀罗DaturastramoniumL.是茄科曼陀罗属植物,又叫曼荼罗、满达、曼扎、曼达、醉心花、狗核桃、洋金花、枫茄花、万桃花、闹羊花、大喇叭花、山茄子等,多野生在田间、沟旁、道边、河岸、山坡等地方,原产印度。曼陀罗原产热带及亚热带,我国各省均有分布。喜温暖、向阳及排水良好的砂质壤土。主要药用成分为具有抗胆碱特性的莨菪碱(hyoscyamine)、东莨菪碱(scopolamine)及阿托品(atropine)等生物碱,具有解痉镇痛、麻醉镇静、止咳平喘、扩张毛细血管、改善微循环以及抗晕船晕车等功效。随着对东莨菪碱药理作用的深入研究和广泛用于临床镇静、戒毒脱瘾、治疗麻痹症、晕动症、胃肠痉挛性绞痛、三叉神经痛和有机磷农药中毒等,在原有巨大市场基础上,其需求还在迅速增长。近年来,国内外对许多药用植物通过诱导子刺激毛状根中次生代谢产物的迅速积累培养体系的建立获得一些珍贵的天然次生代谢产物的研究,获得了令人鼓舞的结果。Zabetakis等比较了在曼陀罗毛状根培养中添加MJ、真菌诱导子(酵母细胞壁,YE)和寡半乳糖醛酸(oligogalacturonides)的诱导效果,结果发现MJ能增加茛菪碱的合成,是所用的3种诱导子中诱导效果最好的。Pitta-Alvarez等考查了不同的生物(SA,YE)和非生物(CaCl2,AgNO3,CdCl2)诱导子对曼陀罗毛状根中茛菪碱生产的影响,结果表明所选用的生物和非生物诱导子都能不同程度地提高茛菪碱的产量。Furze等报道在曼陀罗毛状根中添加7种真菌的培养提取物和非生物诱导子(重金属盐类)都不能提高其次生代谢产物茛菪碱的产量,但非生物诱导子却诱导了倍半萜类植保素的合成,这是在未诱导的毛状根中不能检测到的物质。诱导子还被报道可以在不损失毛状根活力和生产次生代谢产物能力的前提下促进产物从毛状根中释放到培养液中。例如Pitta-Alvarez等报道在曼陀罗毛状根中添加CuSO4后的24,48h时,CuSO4的主要作用就是促进了天仙子碱和天仙子胺向培养基中释放。Furze等报道的真菌提取物和重金属盐虽然都不能提高茛菪碱的含量,但是可以增加茛菪碱释放到培养液中的含量。本试验采用外源性诱导子———茉莉酸甲酯作用于曼陀罗毛状根的研究对获得价格昂贵的天然药物东莨菪碱、莨菪碱具有重要的理论意义和应用前景。1材料表面1.1甲醇甲醇岛津LC-20AD自动进样高效液相色谱仪;培英大容量全温振荡器;色谱柱Symmetry-C18(4.6mm×150mm,5μm);三重蒸馏水、色谱纯甲醇、三乙胺、氨水、乙醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、甲醇均购置于重庆川东化工(集团)有限公司;莨菪碱和氢溴酸东莨菪碱对照品分别购于苏州亚科化学试剂股份有限公司和国家标准物质中心(HPLC≥98%)。1.2pra4质粒而成发根农杆菌pra感染曼不同菌株外植体获得本试验所用曼陀罗毛状根是采用叶盘法,用发根农杆菌C58C1菌种(C58C1是根癌农杆菌经“Disarmed”改造后,保留Helper质粒,导入pRiA4质粒而成的发根农杆菌)感染曼陀罗无菌外植体获得。当毛状根生长至3cm左右时,剪下不同的单克隆分别接种于含500mg·L-1的头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中,每7d剪取毛状根的根尖继代培养,继代5~6次后,将毛状根转移至YEB琼脂培养基上黑暗培养7d,检测毛状根无农杆菌污染后,接种于装有100mL1/2MS液体培养基的250mL三角瓶中作为试验材料,110r·min-1,27℃震荡培养。1.3无水乙醇用量的制备茉莉酸甲酯购自上海三踏生物技术有限公司(批号20073-13-6),以无水乙醇为助溶剂,配置母液,过0.22μm滤膜除菌,加入100mL1/2MS液体培养基中,使MJ终浓度分别为100,150,200,250,300μmol·L-1。2方法2.1诱导测试2.1.1毛状根的诱导诱导向继代培养18d的曼陀罗毛状根液体培养基中添加浓度分别为100,150,200,250,300μmol·L-1的MJ进行诱导处理,设置3个重复,每天观察毛状根的生长状况,每隔3d收获1次,测定毛状根鲜重、干重和东莨菪碱、莨菪碱含量。2.1.2jmj的诱导处理向继代培养18d的曼陀罗毛状根液体培养基中添加MJ(MJ所用浓度由浓度梯度试验决定)进行诱导处理,设置3个重复,分别于处理0,3,6,9,12d后收获,测定毛状根鲜重、干重和东莨菪碱、莨菪碱含量。2.2曼不同培养物的鲜重增殖选取生长旺盛的曼陀罗毛状根,按定量接种法接入装有100mL1/2MS液体培养基的250mL三角瓶中110r·min-1,27℃震荡培养,每三角瓶的接种量约为0.05g(FW)。在为期33d培养过程中,每隔3d随机抽取毛状根培养物3瓶(在诱导试验中,根据处理时间需要进行毛状根鲜重、干重的测定),用蒸馏水冲洗去培养物上的残留液体培养基,并用吸水纸吸干水分后进行毛状根的鲜重测量。并按如下公式计算毛状根培养物的鲜重增殖倍数,毛状根培养物鲜重增殖倍数=(收获鲜重-接种鲜重)/接种鲜重,同时绘制曼陀罗毛状根在不同液体培养基中的生长曲线图。将称量过鲜重的新鲜的毛状根样品于60℃烘箱中烘干(或使用真空干燥泵)至恒重,测定毛状根干重,并按如下公式计算毛状根培养物的干重增殖倍数,毛状根培养物干重增殖倍数=(收获干重-接种干重)/接种干重。2.3ww提取液制备分别准确称取干燥至恒重的不同曼陀罗毛状根系约0.1g,置具塞锥形瓶中,准确加入浓氨水-乙醇-乙醚(4∶5∶10)溶液9.5mL,摇匀、密塞,室温放置12h,常温下超声(100W)提取2次,每次30min,1万r·min-1离心5min,收集上清液,残渣用10mL提取液洗涤,合上清液和洗液,于60℃水浴上蒸干。残渣用1mL0.5mol·L-1硫酸溶解,超纯水洗涤,转移到分液漏斗中,用氯仿萃取3次萃取体积为10,5,5mL,每次萃取后弃去氯仿层,水层用0.5mol·L-1氢氧化钠调节pH至8~9,再用氯仿萃取3次(10,5,5mL),收集合并氯仿液,在水浴上蒸去氯仿,残渣用超纯水溶解并定容至5mL,13000r·min-1离心10min,上清液经0.22μm微孔滤膜过滤,用于HPLC测定。2.4-二氯甲烷-3-甲基-3-甲基-2-硫基苯磺酸h将收获的100mL曼陀罗毛状根液体培养基用稀盐酸将培养液的pH调至2~3,分别用等体积的二氯甲烷提取2次去杂质,再将水相用氨水调至pH9~10,用等体积的二氯甲烷提取2次,合并溶剂,蒸干后用甲醇溶解并定容至1mL,过0.22μm微孔滤膜,即得。2.5东碱、碱含量测定岛津LC-20AD自动进样高效液相色谱仪;莨菪碱和氢溴酸东莨菪碱对照品分别购于苏州亚科化学试剂股份有限公司和国家标准物质中心(HPLC≥98%)。色谱条件:色谱柱Symmetry-C18(4.6mm×150mm,5μm);流动相甲醇-水(20∶80),水中含0.02mol·L-1醋酸钠溶液、0.02%三乙胺,用醋酸调pH至6.0;流速1.0mL·min-1;检测波长215nm;柱温30℃。在该色谱条件下对曼陀罗毛状根中东莨菪碱、莨菪碱进行含量测定,同时准确称取东莨菪碱和莨菪碱5mg,用超纯水稀释成0.5g·L-1母液,1万×g离心10min,分别进样1,2,4,8,16μL,记录相应的峰面积,绘制标准曲线方程。东莨菪碱和莨菪碱的标准峰图见图1,以进样体积和峰面积之间的关系,得出东莨菪碱测定标准曲线为Y=4.492×105X-7496.2,R2=0.9999;莨菪碱测定标准曲线Y=4.819×105X-15176,R2=0.9999,X为相对进样体积,Y为峰面积。3结果与分析3.1曼不同生长阶段毛状根诱导效果曼陀罗毛状根培养约27d左右,毛状根达到生长高峰,毛状根鲜重达到7.275g,干重达到0.709g,在30d达生长稳定期,毛状根的干物质含量不再增加,反而出现下降现象,经检测,毛状根在培养27d左右毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的合成量分别达到0.368,1.146mg·g-1,毛状根生长的稳定期后东莨菪碱和莨菪碱合成明显减慢,且含量降低,因而100mL液体培养27d左右是曼陀罗毛状根收获的最佳时期,在培养18d后,即毛状根由迟缓期开始进入快速生长时进行诱导试验效果最佳,见图2。3.2对曼不同浓度mj培养的培养基中毛状根生长的影响向继代培养18d的曼陀罗毛状根液体培养基中添加浓度分别为100,150,200,250,300μmol·L-1的MJ进行诱导处理,每天观察毛状根的生长形态和变化,随着培养时间的延长,各种MJ浓度培养下的曼陀罗毛状根在培养6d时根尖都逐渐不同程度变黄;培养9d时根尖明显出现不同程度褐化现象,表明根体开始老化;而培养12d的毛状根根体均发黑,毛状根主侧根都很少伸长,侧根稀疏且几乎不再长出新的侧根,整个毛状根系呈松针状,质地变软(糊粉化),表现出较明显的生长抑制。与对照(不添加MJ培养9d的曼陀罗毛状根)相比,分别用浓度为100,150,200,250μmol·L-1MJ处理的毛状根出现不同程度的褐化;而300μmol·L-1浓度培养的毛状根根体发黑,表现出较明显的生长抑制,见图3。与对照(不添加MJ培养9d的曼陀罗毛状根)相比,不同浓度MJ处理的培养基中培养的毛状根鲜重和干重都明显低于对照,其鲜重增殖倍数和干重增殖倍数分别仅为同期对照毛状根的70.3%,65.1%,71.5%,42.8%,29.8%和39.3%,35.7%,38.8%,32.0%,23.7%,这表明不同浓度的MJ均有抑制曼陀罗毛状根生长的作用,见图4。在5个浓度处理中,用200μmol·L-1MJ进行诱导处理的毛状根的鲜重增殖倍数为71.5%,均高于其他几个处理,干重增殖倍数为38.8%,仅略次于100μmol·L-1处理的干重增殖倍数(39.3%),因此考虑用浓度为200μmol·L-1的MJ进行时间梯度诱导处理。3.3浓度对毛状根释放碱的影响与对照(不添加MJ培养9d的曼陀罗毛状根)相比,浓度为100,150,200μmol·L-1MJ处理的毛状根积累的东莨菪碱质量分数分别为0.449,0.413,0.431mg·g-1,均高于对照0.368mg·g-1;而在5个浓度处理中,200μmol·L-1浓度培养的毛状根向培养基中释放的东莨菪碱质量分数最高,达0.594mg·g-1。因此用浓度为200μmol·L-1MJ处理的毛状根产生的总东莨菪碱质量分数为1.026mg·g-1,高于对照0.990mg·g-1和其他浓度梯度处理,见图5。与对照(不添加MJ培养9d的曼陀罗毛状根)相比,浓度为100,150,200,250,300μmol·L-1MJ处理的毛状根积累的莨菪碱含量均低于对照1.146mg·g-1,且随着浓度的升高产生的莨菪碱含量反而降低,呈负相关;而在5个浓度处理中,只有200,300μmol·L-1浓度培养的毛状根向培养基中释放莨菪碱。因此,用浓度为200μmol·L-1MJ处理的毛状根产生的总莨菪碱含量最高为1.158mg·g-1,见图6。综合茉莉酸甲酯各浓度对曼陀罗毛状根生长和毛状根生物碱积累、释放的影响,确定茉莉酸甲酯浓度为200μmol·L-1。3.4生长稳定期毛状根干物质含量的变化曼陀罗毛状根培养约27d(9d对照)左右,毛状根达到生长高峰,毛状根鲜重达到7.2745g,干重达到0.7091g,在30d(12d对照)达生长稳定期,毛状根的干物质含量不再增加,反而出现下降现象,呈现在培养18d(0d对照,CK)开始先增长后降低的趋势;而用浓度为200μmol·L-1的MJ对曼陀罗毛状根诱导处理,6d左右,毛状根提前达到生长高峰,毛状根鲜重达到4.1976g,干重达到0.4149g,也呈现出0d开始先增长后降低的趋势,除了处理3d时的毛状根干、鲜重均高于对照外,其余用MJ处理的毛状根干、鲜重均明显低于未添加MJ的对照毛状根干、鲜重,见图7。3.5曼不同时期东碱含量的变化经检测,毛状根在培养27d(9d对照)左右毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的合成量达最高值,分别达到0.368,1.146mg·g-1,毛状根生长的稳定期后东莨菪碱和莨菪碱合成减慢,且含量降低,呈现出0d开始先增长后降低的趋势。MJ处理后作用结果见表1,经过MJ处理后东莨菪碱含量迅速上升,处理后3d东莨菪碱质量分数达0.419mg·g-1,是同时期对照组的1.36倍;处理后6d东莨菪碱达0.439mg·g-1,是同时期对照组的1.42倍;处理后9d东莨菪碱达0.431mg·g-1,是同时期对照组的1.17倍;处理后12d东莨菪碱达0.374mg·g-1,是同时期对照组的1.12倍。经过MJ处理后莨菪碱含量在短时间(处理后3d)迅速上升,质量分数1.493mg·g-1,是同时期对照组的2.28倍;处理9d后含量低于同时期对照组,呈现出处理3d开始一直降低的趋势。分析结果表明,曼陀罗毛状根MJ处理之后东莨菪碱在短时间内迅速积累,与同时期对照组比较,东莨菪碱含量均增大,最大增幅达1.42倍(处理后6d)。莨菪碱含量呈现出从处理3d开始一直降低的趋势,仅在处理3d时莨菪碱高于同时期对照组2.28倍。3.6东碱质量分数MJ对曼陀罗毛状根东莨菪碱、莨菪碱释放的影响,实验结果表明,用MJ处理3,6,12d后培养基中的东莨菪碱质量分数达0.456,0.872,0.529mg·g-1,与对照组比较,增加了1.13,1.46,1.36倍,处理9d的东莨菪碱质量分数达0.594mg·g-1,略低于对照组0.621mg·g-1。处理3,6,9d后培养基中莨菪碱达0.598,0.435,0.434mg·g-1,未经处理的正常培养组(对照组)培养基和处理12d培养基中未检测到莨菪碱成分,见表2。证明MJ能有效刺激曼陀罗毛状根中东莨菪碱、莨菪碱成分的迅速积累并向培养基中释放。3.7氨基乙酸钠对曼陀罗毛状根总ch-w的影响4东碱的积累和释放通过实验首次证明了茉莉酸甲酯能有效提高莨菪烷类生物碱成分在曼陀罗毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放。从实验结果可知,曼陀罗毛状根中,经MJ处理后6d,东莨菪碱是同时期对照组的1.42倍;MJ处理后6d,培养基中东莨菪碱是同时期对照组的1.46倍。经MJ处理后3d,莨菪碱是同时期对照组的2.28倍;MJ处理后3d,培养基中莨菪碱含量达0.598mg·g-1,而对照组培养基中未检测到莨菪碱成分。已经证明,东莨菪碱是莨菪碱氧化产物,反应向东莨菪碱形成的方向进行,莨菪碱氧化过程不是可逆的。催化莨菪碱氧化形成山莨菪碱进而形成东莨菪碱的莨菪碱6-羟基化酶已经克隆,该酶催化有两步反应,并用于转基因颠茄提高了东莨菪碱的含量。本试验中,用MJ处理后莨菪碱的含量呈现先增加后减少的趋势与东莨菪碱含量的增加和莨菪碱含量的下降同步说明MJ促进曼陀罗毛状根将形成的莨菪碱氧化成东莨菪碱。上述结果还表明,在液体培养的毛状根中莨菪碱和东莨菪碱的积累量增加倍数都不太高,而经MJ处理后,培养液中东莨菪碱和莨菪碱含量的增加倍数较高,说明MJ有利于东莨菪碱和莨菪碱成分向培养基中释放;且在对照实验中培养液中不能检测到莨菪碱含量,但可以检测到东莨菪碱含量,经MJ处理后,培养液中东莨菪碱和莨菪碱含量在一定时间内显著增加,这可能由于东莨菪碱被分泌到培养液中,产物的移出使莨菪碱的转化反应持续进行,这对于曼陀罗毛状根系统形成东莨菪碱的实际应用将是十分有利的,不仅可以提高产率,而且有利于东莨菪碱的分离提取。用浓度为200μmol·L-1的MJ对曼陀罗毛状根诱导处理6d左右,毛状根提前达到生长高峰,呈现出0d开始先增长后降低的趋势,除了处理3d时的毛状根干、鲜重均高于对照外,其余用MJ处理的毛状根干、鲜重均明显低于未添加MJ的对照毛状根干、鲜重。这可能是由于MJ作为一种外源刺激,激发了植物细胞的多种逆境反应,引起细胞抗逆反应产物的表达,促使毛状根由初生代谢更快地转变为次生代谢途径,从而抑制了毛状根的生长。诱导子作为一种外界信号,可以被曼陀罗毛状根细胞膜上的受体所识