预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠的影响

精品文档-下载后可编辑预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠的影响【摘要】目的探讨预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠行为学的影响。方法①采用序贯法测定预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值;②预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠痛行为学的影响;③运用免疫组化技术观察新斯的明对脊髓背角c-fos基因表达的影响。结果①预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值为8.36μg,95%可信区间为6.68～10.70μg;②手术组大鼠累积疼痛评分明显高于F组,预先IT新斯的明可明显降低术后疼痛引起的累积疼痛评分;③与S组相比,新斯的明ED50量明显抑制c-fos蛋白的表达,作用主要产生在Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层,以Ⅰ～Ⅱ层分布最多。结论①预先新斯的明5～15μg鞘内应用可产生剂量依赖性的抗伤害作用;②预先鞘内注射新斯的明的抗伤害作用与抑制c-fos蛋白的表达有关。

【关键词】新斯的明;鞘内注射;切口疼痛模型;C-Fos基因

Theeffectofpreemptiveintrathecalneostigmineonaratmodelofpostoperativepain

GUOYun-he.

SurgeryDepartment,MedicalCollegeofDatongUniversity,Shanxi037009,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofpreemptiveintrathecalneostigminginaratmodelofpostoperativepain.Methods①InvestigationoftheED50(medianeffectivedose)valueofantinociceptionofpreemptiveintrathecalneostigmingbyDixon’supanddownmethodinaratmodelofpostoperativepain;②theefectofpreemptiveintratheca1neostigmingonthenociceptivebehaviorsinratsofpostoperativepain;②immunohistochemistrytechniquewasinvolvedinobservingc-fosproteinexpressionatspinallevel.Results①TheED50valueofantinociceptionofpreemptiveintrathecalneostigmingintheratofmodelofpostoperativepainwas8.36μg,CI(6.68~10.70)μg;②thecumulativepainscoresofratsinoperationgroupweremuchhigherthanthoseofF-operationratsandpreemptiveintrathecalneostigmingdecreasedcumulativepainscoressignificantly;③whenneostigmingwereusedatthedoseofED50,theycouldsignificantlyrepresstheexpressionofc-fosprotein.TheirfunctionalpositionswereattheLayerⅠ-ⅡandⅤ-Ⅵ.ConclusionsPreemptiveintrathecalneostigmingatthedoseof1to10μgcanproducedose-dependantantinociception;②theantinociceptiveeffectsofpreemptiveintrathecalneostigminearemediatedpartlybyinhibitionofc-fosprotein.

【Keywords】Neostigming;Intrathalinjection;Postoperativepainrats;C-Fosprotein

单位:037009山西大同大学医学院外科教研室

新斯的明(NEO)是一种胆碱酯酶抑制剂,近几年实验和临床研究均显示鞘内(IT)NEO具有明显的抗伤害作用和镇痛作用[1]。本研究探讨预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠行为学的影响,为进一步研究提供理论依据。

1材料和方法

1.1药品和试剂新斯的明注射液(Neostigmine上海信谊金朱药业有限公司);羊抗兔c-fos多克隆抗体、PV-6001试剂盒、DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司);异氟醚(isoflurane,Rhone-Poulenc);麻醉机(Dragen),鞘内置管,体质量250~300g的雄性SD大鼠,由山西医科大学实验动物中心提供。以5%的水合氯醛0.6ml/100kg腹腔注射麻醉后,按杨建平法[2]在大鼠蛛网膜下腔植入PE10聚乙烯导管(实验药物均经所埋导管注入蛛网膜下腔),妥善固定,术毕给予20g/L利多卡因注射液20μl。凡是10s内两后肢不能负重、拖地以及针刺小腿无回缩等逃避反应,16～20min以后又恢复负重者为实验动物,饲养5d后用于实验。

1.2切口疼痛模型的建立大鼠吸入1.4%异氟醚麻醉后,将其左后爪进行消毒,按Brerman等[3]法从足底近端0.5cm处向趾部作一长约1cm的切口。切开皮肤,用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割,保持肌肉的起止及附着完整,按压止血,用细线缝合皮肤共两针即成切口疼痛模型。

1.3行为学实验采用累积疼痛评分法[3]评定疼痛强度,待大鼠手术清醒后观察两后爪着地及负重情况,后爪被压迫发白表示负重,如后爪翘起不着地,记2分;如后爪着地但不负重,记1分;如后爪着地并且负重,记0分。从术后1h起每5min观察1次,每次1min,以1min内最常采取的姿势为标准,共观察1h(1～24分),以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分。

1.4序贯实验动物分组根据预实验及确定的有效指标,预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值可能在5～15μg范围,以此范围为准,采用等比系数(r)为1.316,设立5个剂量即5、6.6、8.7、11.4、15μg,取20只大鼠用于序贯实验为新斯的明组;另有一组为生理盐水(0.9%Saline)对照组,为5只大鼠,计为S组。所有大鼠均按随机分配原则入组,而给药时采用单盲法。

1.5c-fos检测动物分组根据序贯实验计算出预先鞘内给予新斯的明的ED50量。取置管成功SD大鼠15只,随机分为三大组,Neo组、S组、F组。Neo组预先鞘内注射新斯的明ED50量行切口术,S组注盐水无药物,行切口术方法;F组不做手术只注盐水。组织采集和样本制备Fos表达的高峰时间为术后2h,因此切口疼痛模型建立2h后采用5%水合氯醛(0.6ml/kg)麻醉,开胸,暴露心脏,经左心室灌流固定。先用200ml0.9%生理盐水快速灌流冲洗血液,继以4%多聚甲醛500ml(0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.4)持续灌注1h左右,接着灌入300ml的20%蔗糖和0.1mol/L磷酸盐缓冲液的混合液。剪开椎板取腰膨大处脊髓在4%多聚甲醛中后固定2h,而后放人20%的蔗糖PBS液中,置4℃冰箱过夜。冰冻冠状连续切片,片厚20μm,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5min/次),3%H2O2灭活内源性过氧酶37℃暖箱中孵育30min,加一抗(c-fos抗体1∶800),37℃湿盒孵育5h,4℃冰箱过夜滴加二抗(羊抗兔),37℃孵育1h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5min/次),DAB显色30min,自来水充分冲洗,脱水、封固镜检,核内棕色颗粒为阳性产物,每组各有一张加PBS液替代c-fos一抗,作为免疫组化的阴性对照。

1.6统计学方法数据均表示为均数±标准差(x±s)。P

2结果

2.1序贯实验

2.1.1预先鞘内注射新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值测定,对照组累积疼痛评分值17±2.9,以累积疼痛评分8.5为镇痛有效指标做出序贯实验结果(见表1表2),根据计算公式得出新斯的明的ED50为8.36μg,95%可信区间为6.68～10.70μg。

表1

预先鞘内应用新斯的明序贯实验结果

剂量(μg)1234567891011121314151617181920

15.0++

11.4++-+

8.7+-+-+++

6.6-+---+

5.0-

表2

预先鞘内应用新斯的明的ED50及95%可信区间

新斯的明剂量D

Dose(μg)对数剂量X

logdose(lgD)

组内动物数

+-

niinin2ED50(μg)95%可信区间(μg)

15.01.176200400

11.41.057311339

8.70.940522248

6.60.820244144

5.00.699011000

合计128811218.366.68～10.70

2.1.2序贯法预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠行为学的影响。对照组大鼠的术侧足常翘起,偶尔着地,但极少负重;Neo组术侧足均可着地,并且负重。与对照组相比,预先鞘内注射Neo组可明显降低累积疼痛评分(P

2.2脊髓灰质内C-Fos阳性表达的结果

2.2.1两药对切口疼痛大鼠行为学的影响

F组大鼠活动如常,双后爪着地且负重;S组大鼠的术侧足常翘起,偶尔着地,但极少负重;Neo组术侧足均可着地,并且负重。与F组相比,手术组大鼠累积疼痛评分均明显升高(P

2.2.2两药对FIL-N的影响S组大鼠于左爪按Brennan法行手术前只注入NS,可使同侧L4-L6脊髓灰质c-fos蛋白表达明显增强,c-fos免疫阳性反应神经元(FLI-N)在各层均有分布,但主要分布在Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层,以Ⅰ～Ⅱ层分布最多。Neo组明显抑制FLI-N的产生,作用主要产生在Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层。

3讨论

序贯法是一种探讨用药剂量或浓度的经典方法[4]。本研究采用此方法探讨预先鞘内注射新斯的明对切口疼痛大鼠产生镇痛作用的有效剂量。从实验结果可看出,预先鞘内给予新斯的明动物阳性和阴性变化比较集中,故结果重复性较好,可靠。

本实验采用的外周伤害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型,此模型是由Brennan等于1997年提出的,施行此手术的大鼠表现自发性疼痛行为、机械性异常疼痛、机械性痛觉过敏,这些疼痛行为与临床上外科手术和术后状态一致[3,5]。

新斯的明(NEO)是一种胆碱酯酶抑制剂,有研究证实脊髓背角Ⅲ、Ⅳ和存在有含Ach的神经元细胞体,其轴突伸向背角层,其内在神经元可与伤害性初级传入纤维形成突触联系,调节伤害性刺激的传入[6]。笔者的实验观察到预先在大鼠切口疼痛模型中IT注射NEO可使大鼠累积疼痛评分明显降低,表明预先NEO鞘内应用有确切的镇痛效果,并呈剂量依赖性;同时脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层FLI-N阳性神经元均较对照组明显减少,提示在脊髓胆碱能镇痛机制中c-fos蛋白的抑制发挥着重要作用。

参考文献

[1]HwangJH,HwangKS,LeemJR,etal.Theantiallodynicefectsofintrathecalcholinesteraseinhibitorsinaratmodelofneuropathicpain.Anesthesiology,1999,90:492-9.

[2]杨建平,蒋豪,吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的改进.中华麻醉学杂志,1993,13:110-112.

[3]BrennanTJ,VandenneulenEP,GebhanGF.Characterizationofaratmodelofineisionalpain.Pain,1996,64:493-501.