rp-hplc法测定不同产地独五味叶木草素的含量

rp-hplc法测定不同产地独五味叶木草素的含量

单味嘴唇科植物是中国藏族、蒙古族、湘西等民族常用的药物。根、茎或全草医疗剂可用于生根、茎或全草科。具有活血、消瘀、止痛的功效，主要治疗跌倒、碰撞、肌肉疼痛、骨质疏松症等疾病。独一味叶中化学成分主要有黄酮类、环烯醚萜苷类和β-谷甾醇。黄酮类有木樨草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷,其中木樨草素为黄酮类化合物主要成分之一。环烯醚萜苷类化合物有山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯和seamoside。DanieiaCristea等用HPLC法测定Weld(ResedaluteolaL.)中木樨草素的含量。本文选择盐酸甲醇浓度(A)、提取液体积(B)、提取时间(C)为考察因素,应用正交实验(L934)考察Soxhle法提取时对测定独一味叶中木樨草素含量的影响,通过优化HPLC法条件,建立了HPLC法测定独一味叶中木樨草素含量的测定方法。方法学评价表明:本文建立的方法简单、快速、重现性好,可为评价独一味及其制剂的质量提供参考依据。1仪器、试剂和仪器Agilem1100Pump,Agilent1100真空在线脱气机,Agilent1100DAD,Agilent1100Workstation,ODSColumn(250mm×4.6mmid,5μm,由中国科学院兰州化学物理研究所制备),0.45μm针筒过滤器,电子天平(SartoriusBP221S,Max220g,d=0.1mg),Soxhle提取器(符合中国药典2000年版一部要求),超声波发生器(CSF-1A型,上海超声波仪器厂),真空干燥器(DZF-6020,上海一恒科技有限公司)。甲醇为色谱纯,水为去离子水,其余试剂为分析纯。木樨草素对照品(批号:111520-200201,由中国药品生物制品检定所提供)。独一味Liamionphlomisrotate(Benth.)Kudo样品(由甘肃省药品检验所宋玉成副主任药师鉴定)。2方法和结果2.1色度条件优化2.1.1木草素的含量分别取标准溶液和样品溶液进样20μL分析。在DAD上木樨草素分别在275nm、350nm处有最大吸收。由于在275nm处其它成分对木樨草素有干扰,故检测波长选择为350nm。2.1.2甲醇对木草素保留时间的影响以不同比例的甲醇和pH=2.7的水为流动相,考察甲醇对木樨草素保留时间的影响,结果见图1。图1中X轴表示流动相中甲醇的不同比例,Y轴表示流动相中不同比例甲醇相对应的保留时间。2.1.3土壤ph值对木草素保留时间的影响以甲醇￣水(55∶45,v/v)为流动相,将水用乙酸调节成不同的pH值,考察pH值对木樨草素保留时间的影响,结果见图2。图2中X轴表示不同pH值的流动相,Y轴表示不同pH值的流动相相对应的保留时间。2.1.4检测波长和温度流动相:甲醇-水(5∶45,v/v,水用乙酸调pH=2.7),检测波长:350nm,C18柱(250mm×4.6mmid,5μm),流速:1.0mL·min-1,进样量20μL。2.2方法学评价2.2.1标准曲线的制备将木樨草素对照品置于真空干燥器中干燥2h(真空度-0.06MPa),精密称取约10mg置于10mL量瓶中,用甲醇定容,摇匀,作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液用甲醇分别稀释制备成系列浓度的对照品溶液,经0.45μm针筒过滤器过滤后,每次进样20μL。以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得标准曲线Y=99.78+1523.42X,r=0.9998,n=5。结果表明:木樨草素在0.0188～18.8μg范围内呈良好的线性关系。2.2.2准确度的研究将同一对照品溶液在本文确定的色谱条件下连续进样5次,5次峰面积的RSD=1.43%(n=5)。2.2.3审查的重复将同一样品分为5份,按本文确定的方法提取、测定,5份样品峰面积的RSD=2.08%。2.2.4稳定性试验结果将不同浓度的两份对照品溶液,分别存放于室温(20～25°C)和冰箱(4°C),在本文确定的色谱条件下按设定时间分别进样,记录峰面积,结果见表1。表1中以放置2h时测得的峰面积为100%,据此计算出样品放置不同时间后峰面积的相对值Y(%),以相对值Y(%)的变化判断其稳定性。由表可知,在室温下放置6h内稳定,而在冰箱中保存12h内稳定。2.2.5加标回收率测定精密称取已知木樨草素含量的样品,加一定浓度的对照品溶液,按含量测定方法测定,计算回收率,结果平均回收率为98.8%,RSD为1.67%,n=5。2.3样品测定2.3.1soxhde法提取独一事叶中木草素含量的确定以盐酸甲醇浓度(A)、提取液体积(B)、提取时间(C)为考察因素,以木樨草素含量为评价指标,应用正交实验L934(见表2因素水平表)考察Soxhle法提取时对测定独一味叶中木樨草素含量的影响,结果见表3。由表3可知:Soxhle法提取独一味时,以木樨草素含量为评价指标,最佳组合条件为A1B3C3。即用1.5%盐酸甲醇溶液160mL提取1.5h。2.3.2样品的提取和进样精密称取独一味干燥样品粉末约0.5g,在Soxhle提取器上用1.5%盐酸甲醇溶液160mL提取1.5h。将溶剂挥干,残渣用甲醇移入10mL量瓶中,用甲醇定容。在本文确定的条件下进样分析,进样前将对照品溶液、样品溶液通过0.45μm针筒过滤器过滤后,每次进样20μL。对照品、样品色谱图见图3、图4,不同产地独一味叶中木樨草素的含量见表4。3讨论3.1流动相酸度的影响随着流动相中甲醇比例的增大,保留时间逐渐减少,减少趋势也放缓。本实验采用55%甲醇作为