桑蚕多倍体化学诱变技术体系的建立与应用

桑蚕多倍体化学诱变技术体系的建立与应用

多倍植物细胞中含有2组以上的染色体。桑树四倍体种质资源是开展桑树多倍体育种及遗传研究的基础材料,但天然的四倍体桑树植株,特别是农艺性状优良的四倍体桑树植株来源较少,因此,采用物理或化学方法人工诱导的四倍体桑树植株成为三倍体桑树优良品种选育的亲本来源在本项研究中,我们选择8个桑树品种和11个桑树杂交组合,进行桑树多倍体的化学诱导试验,筛选适合桑树多倍体诱导的试剂组合,以及可以替代秋水仙素的诱导剂,并改进和丰富桑树多倍体化学诱变技术体系中的诱变方法、诱变材料,旨在为今后采用化学诱变的方法高效获取桑树多倍体植株提供可行的实用技术,同时为多倍体桑树品种的选育提供优质素材。11.1药物、药物和试剂供试桑树品种苏湖16号、育71-1、冀黄鲁选、金10、湖桑32号、大白椹、绿椹子、中桑5801,供试桑树杂交组合丰驰桑、塘10×伦109、塘10×会农3号、中桑5801×桐乡青、中桑5801×育2号、中桑5801×711实选、中桑5801×育124号、881×岐山2号、保坎61号×育2号、绵游1号×711实选、绵游1号×育2号,均来自国家种质镇江桑树圃。诱导药剂秋水仙素购自上海索莱宝生物科技有限公司,氟乐灵(trifluralin,48%乳油)购自江苏省镇江农药厂有限公司,二甲基亚砜(DMSO)购自北京恒业中远化工有限公司。6-苄基腺嘌呤(N6-Benzylaminopurine,6-BA)购自北京恒业中远化工有限公司。染色体镜检所用试剂苯酚品红及卡诺固定液由本实验室配制,8-羟基喹啉购自国药集团化学试剂有限公司。1.2试剂及其应用试验采用丰驰桑种子播种,当种子萌发出2片子叶时进行诱导处理。将秋水仙素、秋水仙素+DMSO、氟乐灵、氟乐灵+DMSO4组药剂分别配制成不同浓度的药液,每组试剂的每个浓度梯度为1个试验区,每区播种120粒桑种,发芽幼苗100株左右。将配制的药液分别采用滴液法1.3不同黑莓材料和不同诱导处理方法的诱导效应测试1.3.1黑莓种子发芽幼苗的诱导选择除丰驰桑之外的10个桑树杂交组合供试,用初筛诱导剂组合进行诱导,种子萌发、诱导处理及调查方法同“1.2”。1.3.2桑树幼芽诱导处理选择处于生长期的育71-1、苏湖16号、金10、冀黄鲁选4个综合性状优异品种的9年生桑树植株(每个品种5株),供试桑树植株在春伐后幼芽萌发至脱苞期前采用琼脂涂抹法诱导处理:在3%琼脂中分别加入初筛诱导剂组合及3.0mg/L6-BA,固定于幼芽5d,当幼芽生长至雀口期及1~2叶期,分别更换上述琼脂组合诱导剂2次。另参照“1.2”的滴液诱导处理方法,用初筛诱导剂组合对4个品种的春伐桑幼芽进行诱导。正常生长15d后调查形态变异株的数量。1.3.3高精精的诱导剂选用桑树品种湖桑32号、大白椹、绿椹子、中桑5801的雌花供试,在春季雌花授粉前用硫酸纸套袋,到授粉期人工授粉后,随即采用一次性注液器在雌花和雌花下部皮孔注射初筛的组合诱导剂;当授粉2~3d后雌花花柱萎缩时揭去硫酸纸,继续注射诱导5~7d(1次/d)。收集成熟桑椹,淘洗后各供试品种选取300粒种子播种,发芽后调查形态变异株的数量。1.3.4黑莓种子诱导选择除丰驰桑之外的10个桑树杂交组合的桑种子,以浸渍法1.4真菌病毒防治诱导处理桑苗每星期喷洒1次500倍多菌灵稀释液,预防真菌病害发生,每隔15d喷施1000倍敌敌畏稀释液1次,防治介壳虫和其它害虫。1.5四种诱导的黑莓果实的测定1.5.1植物形态变化的观察观察诱导后桑树植株的长势、叶形大小、叶肉厚薄、叶色、皮孔、桑芽着生状态,调查公斤叶片数。1.5.2普通显微镜检选取各供试桑树品种及杂交组合诱导产生的形态变异植株中最类似于四倍体的植株(如出现叶肉增厚、叶色变深、茎杆变粗等形态改变),每个品种及杂交组合选取3株以上,于每日9:00~10:00细胞分裂旺盛时期取顶芽作为普通显微镜镜检的材料。样品置于0.002mol/L8-羟基喹啉溶液中预处理4h,再用卡诺固定液固定3h后采用酸醇解离液(37%HCl与100%乙醇体积比为1∶1)解离3min。然后经清水漂洗3次,用改良苯酚品红溶液进行染色,染色后随即压片,显微镜观察并拍照。1.5.3观察样品及其处理取桑树品种育71-1的二倍体及经染色体鉴定的诱变四倍体植株的叶片,用QUANTA200扫描电子显微镜(荷兰FEI公司产品)观察是否发生气孔、叶脉和茎的形态差异。观察样品处理:取1cm×1cm幼叶,用4%戊二醛(pH7.2,0.2mol/L磷酸缓冲液配制)固定,0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)清洗;乙醇梯度脱水(30%乙醇,15min→50%乙醇,15min→70%乙醇,15min→90%乙醇,15min→100%乙醇2次,每次15min);醋酸异戊酯置换2次,每次15min;临界点干燥;导电处理(15mA,90s)。22.1不同浓度dmso诱导剂对死亡植株的诱导以不同化学诱导剂组合及梯度浓度对丰驰桑幼苗的顶芽连续诱导7d后,部分桑苗出现死亡,且各个试验区的死亡植株数目存在一定的差异。存活植株在自然生长条件下继续生长10d后观察到了数量不等的形态变异株(表1),其形态变异主要表现为茎杆变粗(图1-C)、腋芽提前萌发(图1-D)、幼叶同时萌发及增厚(图1-E)、子叶外形出现畸形(图1-F)、叶色加深(图1-G)、生长变得缓慢(图1-H)、叶缘多锯齿等。从表1可见:仅以秋水仙素或仅以氟乐灵为诱导剂,随着诱导剂浓度的增加,诱导产生的死亡植株也随之增加;以0.2%秋水仙素与3种浓度DMSO组合的诱导剂、400倍氟乐灵稀释液和3种浓度DMSO组合的诱导剂进行诱导,随着DMSO浓度的提高,死亡植株有所增加,但并不明显;以氟乐灵及其与DMSO组合的诱导剂诱导,植株的死亡率明显高于秋水仙素及其与DMSO组合的诱导剂。综合比较后,筛选0.2%秋水仙素+2%DMSO作为诱导剂,对不同桑树材料进行诱导试验。2.2不同黑莓材料和不同诱导处理方法的诱导效应2.2.1桑树幼苗顶芽采用滴液法处理的诱变效果以0.2%秋水仙素+2%DMSO为诱导剂,采用滴液法对10个杂交桑组合的幼苗顶芽进行诱导后,10个杂交桑组合的幼苗均出现形态变异株,其株平均变异率达到30.96%。2.2.2春伐桑幼芽采用水仙素诱导剂处理的诱变效果鉴于春伐桑为生长在室外的9年以上的桑树,诱导时往往受到天气等因素的影响,为了达到诱导剂对桑芽的持续效果,用0.2%秋水仙素+2%DMSO组合诱导剂配制成的琼脂液对春伐桑幼芽进行涂抹诱导,结果4个供试桑品种的幼苗形态变异率平均达到10.12%,而用滴液法诱导的幼苗形态变异率较低,平均为6.67%。2.2.3桑板栗幼苗期间发芽率及形态变异率用0.2%秋水仙素+2%DMSO为诱导剂,采用注射法诱导处理雌花后,收集成熟桑椹淘洗种子播种,结果供试品种间发芽率及形态变异率开差较大,并且形态变异植株的数量总体上很少,形态上与多倍体类似的植株更少,4个供试桑品种萌发的546株幼苗中仅产生14株形态变异植株,变异率为2.56%。2.2.4浸渍桑种子诱导与清水浸渍的种子相比,各供试杂交桑组合的种子用不同诱导药剂浸渍后的发芽时间明显延长,其中0.2%秋水仙素+2%DMSO试验区的发芽时间最长。供试桑种子用诱导药剂浸渍到破壳后,根部均加粗,移栽后恢复正常生长一段时间后,发生不同程度的形态变异,如茎杆100%变粗,同时萌发3~4片子叶,叶缘锯齿加深,生长缓慢等(图2)。随着浸渍诱导处理时间延长或诱导剂浓度增加,种子生根及形成子叶难度加大,死亡率逐步上升,成活的变异植株数量也逐步减少。用0.2%秋水仙素+2%DMSO浸渍桑种子9d获得变异植株的比例高达100%,成活的突变植株也相对较多,供试的10个杂交桑组合最终获得的成活幼苗形态变异率平均为11.9%;采用400倍氟乐灵稀释液浸渍桑种子5d与0.2%秋水仙素+2%DMSO浸渍桑树种子9d的诱导效果相当,10个杂交桑组合获得的变异植株的比例高达100%,最终获得的成活幼苗平均为12.4%。该试验结果表明,可以400倍氟乐灵稀释液替代秋水仙素浸渍桑种子诱导桑树多倍体。2.3诱导突变桑树多倍体的测定2.3.1变异植物的形态变化对桑品种育71-1具有多倍体表型特征的植株进行观察,发现部分植株的长势旺盛(图3-B2.3.2倍体的获得从形态观察确定的上述各种桑树材料获得的变异植株中,选择与四倍体桑树表型相似的植株进行细胞染色体鉴定(图4),确定苏湖16号、育71-1、冀黄鲁选、丰驰桑、中桑5801×桐乡青、中桑5801×育2号、中桑5801×711实选、中桑5801×育124号、881×岐山2号、保坎61号×育2号、绵游1号×711实选、绵游1号×育2号共12个桑树品种或杂交组合获得了四倍体植株或枝条。2.3.3倍体叶片的气孔大小以桑树品种育71-1的二倍体以及化学诱导并经染色体鉴定的四倍体植株的叶片为材料在电子显微镜下观察发现,与二倍体的叶片相比,四倍体叶片的气孔较大(图5-A图5-A3桑树多倍体的诱导研究进展秋水仙素是人工化学诱导多倍体植物使用最为广泛的的诱导剂本项研究根据不同桑树材料的特点,采用了不同的诱导处理方法。对在田间生长的春伐桑树幼芽进行诱导处理时,为防止太阳光直接照射或阴雨天影响滴液诱导效果,因此选择琼脂涂抹法进行诱导处理,这样不仅可以使得培养基中的诱导剂对细胞分裂产生持续的影响,而且可以减少大规模诱导时反复滴液的工作量,诱导时只要隔天更换琼脂即可。又如用滴液法或琼脂涂抹法诱导雌花,无法使诱导剂渗透进入花蕊,故选择注射处理方法诱导,获得了较为理想的效果。桑树种子在发芽时会吸收大量水分,因此采用浸渍法处理可使诱导剂随之渗入而对分裂中的细胞产生影响。在试验中以0.2%秋水仙素+2%DMSO对桑树种子诱导9d的效果最好。尽管桑种子浸渍诱导后萌发的幼苗需移栽,并且移栽后桑苗成活率较低,但获得幼苗的变异率达到100%,且一旦桑苗移栽成活,染色体镜检后发现多为多倍体植株。氟乐灵是二硝基苯胺类除草剂,也是一种有丝分裂抑制剂,与秋水仙素的诱导作用类似,能在细胞有丝分裂过程中与微管蛋白二聚体结合,形成微管蛋白复合体,进而使得微管解聚合,抑制纺锤丝的形成,使染色体加倍本研究筛选出了适合桑树多倍体诱导的试剂组合以及可以替代秋水仙素的诱导剂,改进和丰富了桑树多倍体化学诱变技术体系。通过形态观察、细胞染色体鉴定、植株叶片形态的电子显微镜观察,最终确认在12个桑树品种或杂交组合中获得一批四倍体植株或枝条,丰富了桑树多倍体育种的亲本材料。(References)[1]JiangLY,QianZQ,GuoZG,[2]VilatersanaR,BrystingAK,BrochmannC.Molecularevidenceforhybridoriginsoftheinvasivepolyploids[3]HegartyMJ,HiscockSJ.Genomiccluestotheevolutionarysuccessofpolyploidplants[J].CurrBiol,2008,18(10):R435-R444[4]ZhangXY,HuCG,YaoJL.Tetraploidizationofdiploid[5]AbleJA,LangridgeP,MilliganAS.Capturingdiversityinthecereals:manyoptionsbutlittlepromiscuity[J].TrendsPlantSci,2007,12(2):71-79[6]陈方永,罗君琴.玉环柚三倍体植株育成技术研究初报[J].浙江农业科学,2006(5):513-517[7]RaiMK,AsthanaP,SinghSK,[8]张正国.人工三倍体桑品种丰田10号试栽成绩简报[J].蚕桑通报,2010,41(1):26-27[9]余茂德,敬成俊,吴存容,等.人工三倍体桑树新品种嘉陵20号的选育[J].蚕业科学,2004,30(3):225-229[10]林强,朱方容,邱长玉,等.广西四倍体桑种质资源研究进展[J].广西农业科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