冰冻切片机破碎大鼠心肌组织提取rna的方法

冰冻切片机破碎大鼠心肌组织提取rna的方法

获得高质量的自然资源是研究生物材料的必要条件和关键技术。1材料和方法1.1合成构建聚合物LeicaCM1900冰冻切片机(德国Leica公司),市售合成胶水,ND-1000微量紫外可见分光光度计(美国NanoDrop公司),全自动凝胶成像系统GelDocXR1.2nase消除所用研钵、剪刀、镊子、离心管(Ep管)、枪头等器具,均经0.1%DEPCH1.3gaaggaacrtgac-3,apos的结构根据GenBank上公布的β-actin基因序列设计引物:P1:5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3',P2:5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3';所扩增的目的片段长度约为445bp,引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。1.4中心提供服务雄性SD大鼠,体重350~370g,由泸州医学院实验动物中心提供。操作人员戴上口罩和手套,麻醉大鼠,取出心脏,立即用剪刀剪成3mm×3mm×3mm左右的小组织块,每粒组织放入一个做好标记的0.2ml的EP管内,立即置入液氮中保存。1.5液氮研究进展将样本分成两组,即液氮研磨法组和冰冻切片法组,分别提取RNA。(1)液氮研磨法:抽提前先在碾钵中加入适量的液氮,再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨成粉末状后,等待剩余液氮恰好挥发完时,立即加入1mlTRNzol裂解液继续快速匀浆。然后按照RNA(小量)抽提试剂盒说明书方法提取RNA。使用液氮碾磨要特别注意一点:在整个碾磨过程中,样品不得融化,因为解冻后内源RNase更容易起作用破坏RNA;(2)冰冻切片法:将液氮中保存的装有大鼠心肌组织的EP管取出后立即快速放入冰冻切片机箱体中。在样本头上滴加适量的合成胶水,将样本粘在样本头上,以4μm的厚度连续切片切完样品,注意不要切到胶水部分。用枪头将切出来的组织碎片,快速转移到预先加了1mlTRNzol裂解液的1.5ml的Ep管中,充分混匀。然后按照RNA(小量)抽提试剂盒说明书方法提取RNA。1.6任浓度、纯度和完整性试验取1μl提取的RNA,用微量紫外分光光度法测定其浓度、OD1.7—β-actin基因的RT-PCR扩增按FirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行逆转录(RT),引物为Oligo(dT)2结果2.1对羟基温度和浓度的紫外扫描紫外分光光度法测得RNA浓度液氮研磨法组为2.59μg/μl,冰冻切片法组为2.05μg/μl。紫外吸收OD2.2冻切片法提取rna的两组典型条带琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,液氮研磨法和冰冻切片法提取的RNA,可见两条明显的条带(图1)。28srRNA与18srRNA条带亮度之比大于1,说明RNA未被降解。2.3—β-actin基因的PCR扩增结果分析反应产物用琼脂糖电泳分析,在约445bp处有明亮条带显示(图2),与预计长度一致。3冰激凌切片机切片提取高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达等分子生物学研究的前提。样品离开活体或者原来的生长环境后,样品中的内源RNase即会开始降解RNA,降解速度与内源酶含量及温度呈正相关。组织RNA提取时,在研磨破碎组织操作中,关键的环节是使组织细胞尽快与裂解液充分接触,从而抑制RNase活性。但由于组织块有一定的厚度,裂解液不能快速渗入,导致内源性RNase降解RNA增加,使提取的RNA质量下降。因此,如果能在研磨破碎组织操作中抑制RNA酶活性,降解问题也就可以解决了。液氮碾磨就是目前使用最多、最有效的一种办法细胞的平均直径为10~20μm,冰冻切片机切片厚度可以达到几微米,完全能够充分地将细胞切碎。本课题组在实验工作中,发现用冰冻切片机来切冰冻组织时,如果采用较薄的厚度进行切片,完全能够达到破碎组织细胞的目的。冰冻切片机切片过程中,环境温度可以维持在大约-25℃~-30℃的较低水平,RNA酶活性也能被充分抑制。而且冰冻切片机切片迅速,如果操作人员动作熟练,可以在很短的时间内完成操作,将切出来的组织快速溶解在裂解液中,再做后续提取RNA的实验操作,能获得高质量RNA。通