浮游植物叶绿素a测定方法的比较研究

浮游植物叶绿素a测定方法的比较研究

a芽、浮游生物密度和藻类分类是当前浮游生物监测的重要参数，对监测和监测洪水流量提供了最直接、最有效的数据。浮游植物密度和分类计数的分析难度大,对专业要求较高,分析进度缓慢。相对而言,叶绿素a含量的测定方法较为简单,其中分光光度法应用最为广泛。《水和废水监测分析方法》(第四版增补版)采用分光光度法作为叶绿素a的常规监测方法,以90%丙酮为溶剂研磨提取叶绿素a。该方法充分破碎藻类细胞壁,对叶绿素a的提取效率高。但研磨过程中叶绿素a容易发生光降解使结果偏低,提取过程繁琐,人为误差较大。此外,研磨过程花费较多时间,与丙酮的接触时间长,不利于操作人员的健康。不少研究从提取溶剂本文研究了3种滤膜(乙酸纤维滤膜、混合纤维滤膜和玻璃纤维滤膜)对叶绿素a测定结果的影响,比较了丙酮浸提法、丙酮研磨法、乙醇法和热乙醇法的方法稳定性和可替代性。1材料和方法1.1碳酸镁悬浊液水样取自中山市逸仙湖公园的人工湖湖水,样品采集后立即加入1%碳酸镁悬浊液(1L水样加1%碳酸镁悬浊液1ml),以防酸化引起色素波长偏移。3种滤膜:孔径0.45μm的乙酸纤维滤膜(上海兴亚)、孔径0.45μm的混合纤维滤膜(天津津腾)、孔径0.7μm的进口玻璃纤维滤膜(WathmanGF/F);孔径0.45μm的聚四氟乙烯针式抽滤器;玻璃研钵。1.2江苏ws型真空泵(天津奥特赛恩AP-01D)、台式低速离心机(江苏恒丰TD5A-WS型)、恒温水浴锅(上海一恒HWS-24)、紫外可见光分光光度计(上海亚研电子UV1900PC)、医用保温冰箱(海尔DW-25W198)等。1.3实验方法1.3.1%丙酮实验经24h浸泡活化的乙酸纤维滤膜、混合纤维滤膜和玻璃纤维滤膜放入冰箱低温干燥,分别放入10ml试管中,加入90%丙酮10ml,每组实验设3个平行。暗处浸提24h后,以90%丙酮作空白对照,测定上清液在630nm、645nm、663nm、750nm处的吸光值,比较3种滤膜对90%丙酮吸光度的影响。1.3.2不同溶剂提取液对样品叶绿素a含量的影响分别用乙酸纤维滤膜、混合纤维滤膜和玻璃纤维滤膜过滤同一水样丙酮研磨法是样品滤膜剪碎后,加入90%丙酮、适量碳酸镁充分研磨,于暗处浸提24h以90%丙酮为溶剂的方法,分别在630nm、645nm、663nm、750nm下测定提取液的吸光度,计算样品叶绿素a含量1.3.3滤膜冷冻与否对乙醇法测定叶绿素a含量的影响将一组浓缩样品的滤膜于-20℃下冷冻8h后,加入90%乙醇10ml,暗处萃取浸提24h,另一组浓缩样品的滤膜直接加入90%乙醇10ml,暗处萃取浸提24h,每组实验3个平行,比较滤膜冷冻与否对乙醇法测定叶绿素a含量的影响。1.4数据分析数据用SPSS(12.0中文版本)进行显著性分析(0.01<P<0.05差异显著)。2结果和讨论2.1分光光度计算c乙酸纤维滤膜和混合纤维滤膜均可溶解于90%丙酮。玻璃纤维滤膜吸水膨胀,但不发生溶解。实验结果表明,三种滤膜的吸光度波动小于0.0010,在分光光度计的光度波动范围内(0.001Abs),750nm处吸光度符合小于0.005的要求(见表1)。经检验,三种滤膜的实验结果无显著性差异(P>0.05),对90%丙酮吸光度测定没有影响。(表2)由于研磨时加入的碳酸镁在倾倒上清液时容易再悬浮,使得上清液比色时750nm处吸光度超过0.005。即便用滴管小心吸取上清液,也容易带出碳酸镁。张帼等人2.2丙酮浸提法和丙酮研磨法的比较如图1所示,分别用乙酸纤维滤膜、混合纤维滤膜、玻璃纤维滤膜过滤同一水样,三种滤膜对丙酮浸提法和丙酮研磨法测定的叶绿素a含量无显著影响(P>0.05)。尽管乙酸纤维滤膜和混合纤维滤膜能溶解在丙酮中,但在本实验中对测定结果无影响,所以可根据实验室获得便利及价格来选择使用以上三种滤膜进行叶绿素a测定,这与林少君等人在统计学意义上,丙酮浸提法和丙酮研磨法测定叶绿素a无显著差异,两种方法可以相互替代。但丙酮研磨法测定的结果稍低,误差较大,可能是研磨步骤较多,多次转移,造成样品损失。与丙酮浸提法测定结果的平均值比较,研磨法所造成的损耗率为16.68~41.10%,平均值为32.91%。一些研究者2.3乙醇法替代热乙醇法热乙醇法多了80℃水浴2min的步骤,测定结果和乙醇法的没有显著差异(P>0.05)。热乙醇法的平行性差,偏差较大(图2),加热过程中80℃水浴较难控制,容易发生样品喷发而造成样品损失,建议用乙醇法直接替代热乙醇法测定叶绿素a含量。杨玉珍等人如图3所示,滤膜富集样品后,是否在-20℃下冷冻8h对乙醇法测定叶绿素a含量没有显著差异(P>0.05)。未冷冻直接浸提只是利用乙醇溶液渗透到藻细胞内提取叶绿素a。-20℃下冷冻8h后再用90%乙醇萃取,冷冻再融解的过程可以引起细胞溶涨2.4不同提取方法的标准曲线的分析经显著性分析,本实验中丙酮浸提法与乙醇法的测定结果有显著性差异(P<0.05),其它方法的测定结果并无显著性差异(见图4)。相对于丙酮研磨法和热乙醇法,丙酮浸提法和乙醇法的标准偏差较小,前处理步骤简化,只需将滤膜放入离心管,加入萃取剂后静置浸提24h,整个提取过程没有溶液的转移,操作简便,转移损失更小。从统计意义上来说,丙酮浸提法的测定结果普遍比乙醇法高,说明90%丙酮提取浮游植物的叶绿素a较90%乙醇提取更完全。这是因为丙酮的穿透性强,容易渗透到浮游植物细胞中,而乙醇的性质决定了其萃取效率不高由于丙酮法作为标准方法被长期使用,为了历史数据的可比性,可以使用步骤简化但更安全的丙酮浸提法。乙醇法无毒害,结果可靠,建议在水体浮游植物叶绿素a监测工作中推广。3叶绿素a含量3.1乙酸纤维滤膜、混合纤维滤膜、玻璃纤维滤膜对90%丙酮的吸光度影响很小,对丙酮浸提法与研磨法的测定结果无显著影响,可以根据需要选择以上三种滤膜。3.2丙酮浸提法与研磨法测定的叶绿素a含量无显著差异,可相互替换,但丙酮研磨法的平均损耗率为32.91%,误差较大。3.3乙醇法与热乙醇法测定的叶