稻虾共作模式下克氏原螯虾菌群多样性分析

稻虾共作模式下克氏原螯虾菌群多样性分析

元宝虾，俗称小龙虾，广泛分布于湖北、江苏、安徽、浙江、湖南、山东等省。近年来，随着稻虾种养模式的推广，产业规模迅速增长，已成为中国重要出口创汇水产品之一微生物菌群在水产养殖中发挥重要作用，研究表明菌群与寄主健康有着密切的联系，如凡纳滨对虾感染WSSV后，肠道菌群组成和功能与健康虾相比差异明显高通量测序技术因其能完整反映测试样品的菌群结构特征，逐渐成为研究微生物菌群结构的重要工具1材料和方法1.1样品采集和测试方法试验地点位于江苏省宿迁市宿豫区（33°97′32″N,118°32′30″E），属于亚热带气风气候，年均降雨量1400mm，采样地点稻虾共作已有5年，面积2.5hm采样时间为2019年8月20日上午8:00—9:00，从池塘随机采集5尾大小相近的健康克氏原螯虾，平均体质量为（23.5±1.8)g，平均体长（9.5±0.2)cm。设置一个固定采样点，距离岸边2m，分别用灭菌过的有机玻璃采水器和采泥器采集水样（水面下0.5m）和底泥（水底表层5cm），装入无菌采水瓶和采样袋。采集样品均置于冰盒中运至实验室。稻虾共作水体pH值的测量使用PHBJ-260便携式pH测定仪型（上海精密仪器厂生产）；水温测定使用WNY-01直形棒式普通玻璃温度计，在水深0.5m和1.5m处分别测量取平均值；溶解氧采用YSIDO200型便携式溶解氧测定仪（北京康高特科技有限公司生产）；其余各项水化指标的测定均按照《水和废水监测分析方法》在实验室内完成1.2肝胰腺、肝胰腺、肝胰腺样品运至实验室后，立即在超净工作台无菌环境下，对5尾小龙虾体表进行消毒、解剖，分别收集肠道内容物、肝胰腺、鳃，充分混合置于无菌离心管；取水样50mL，用孔径为0.22μm无菌纤维素滤膜过滤，过滤后，滤膜置于无菌离心管，底泥充分混合后置于无菌袋中。5份样品处理完成后立即放入干冰盒中，送至南京鑫普华生物科技有限公司进行样品处理及测序，具体测序方法、步骤按照文献1.3基于daseq软件的plap序列筛选测序后，根据序列首尾两端的Barcode和引物区分样品，并调整序列方向，Barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；用Pandaseq软件，根据PEreads之间的Overlap关系，将成对Reads拼接（merge）成一条序列，最小Overlap长度为10bp；拼接序列的Overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；用PRINSEQ软件，过滤reads平均质量值20以下的碱基，过滤掉N碱基数量大于5的序列；用Usearch软件，采用Denovo和Uchime结合的方式去除嵌合体，使用Gold数据库。1.4统计分析方法1.4.1otu聚类分析将序列完全一样的Cleanreads归为一种Tag，并统计每条Tag对应的丰度（即reads数目），将其中的Singletons（对应reads只有一条的序列）过滤掉，利用Usearch在0.97%相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU(OperationalTaxonomicUnits）。从各个OTU中挑选出丰度最高的一条序列，作为该OTU的代表序列。使用Uclust方法，将该代表序列与已知物种的16S数据库（Silva数据库）进行比对，从而对每个OTU进行物种归类。1.4.2物种多样性评估Alpha多样性（AlphaDiversity）是对某个样品中物种多样性的分析，包含样品中的物种组成的丰富度（Richness）和均匀度（Evenness）两个因素，通常用Observedspecies指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数以及PD＿whole＿tree指数等来评估某个样本的物种多样性。Observedspecies指数和Chao1指数反映样品中群落的丰富度（Speciesrichness）。Shannon指数以及Simpson指数反映群落的多样性（Speciesdiversity),PD＿whole＿tree指数反应了样品中物种对进化历史保存的差异，PD＿whole＿tree指数越大说明物种对进化历史保存的差异越大。Goods＿coverage指数反应了测序的深度，指数越接近于1，说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。1.4.3距离聚类分析Heatmap是以颜色梯度来代表数据矩阵中数值的大小并能根据物种或样品丰度相似性进行聚类的一种图形展示方式。利用R语言Vegan包，Vegdist和Hclust进行距离计算和聚类分析；用chao算法计算距离，complete方法聚类，聚类结果加上样品的处理或取样环境分组信息，可以直观观察到相同处理或相似环境样品的聚类情况。1.4.4broa重测学模型为了进一步展示样品间物种多样性差异，使用PCoA的方法展示各个样品间的差异大小。基于Braycurtis距离、WeightedUnifrac距离和UnweightedUnifrac距离来进行PCoA分析。为了便于作图处理，稻虾共作模式下所取试验样品水体、底泥、肠道、鳃、肝胰腺分别用英文缩写CW、CS、CI、CG、CH代替。2结果与分析2.1化学需氧量cod采集的稻虾共作水质指标如下：水温（27.6±0.1）℃，pH(8.11±0.05），化学需氧量（COD）为（23.31±1.8)mg/L，硝酸盐（NO2.2随机抽平处理对稻虾共作各样品中高通量测序的结果进行统计（表1），在过滤掉低质量碱基序列和嵌合体后，5个样品共计获得有效序列393519个，平均78703.8，水体最多为94687，肠道最少为48659。为了保证后期分析结果合理，对每个样本的数据进行随机抽平处理，抽平数量按照最低样本数量进行抽平，抽平数量为48659，将一致性在97%以上的序列聚类成一个OTU分类操作单位，5个样品抽平后共计聚类7223个OTU，平均1444.3，底泥样本最多为2064，鳃最少为831，测序深度99.25%～99.78%，说明试验样本中序列没有被检测出的概率较低。Alpha多样性发现Chao1指数、Observed-sopecies指数由高到低顺序依次为底泥>肝胰腺>肠道>鳃>水体，Simpson、Shannon指数由高到低顺序依次为底泥>肝胰腺>肠道>水体>鳃。说明底泥细菌丰度和多样性最高，水体细菌丰富度最低，鳃菌群多样性最低。2.3不同样品优势种群的分类在门分类水平上，选取最大丰度前20个物种进行分析（图2），发现各样品菌群主要为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。变形菌门是底泥和鳃的优势菌门，是水体次优势菌门，占比均较大，其中鳃占比超过90%；厚壁菌门是肠道和肝胰腺优势菌门，占比均超过40%；放线菌门是水体优势种群，但在其他样品中占比较少。在属分类水平上（表2），水体、底泥、肠道、鳃、肝胰腺5个样品优势种群分别为放线菌门的hgcIclade(32.1%）、厚壁菌门的芽孢杆菌属（Bacillus2.1%）、柔膜菌门的CandidatusBacilloplasma(11.8%）、变形菌门的红育菌属（Rhodoferax87.2%）和厚壁菌门的芽孢杆菌属（Bacillus12.9%），各优势种群在样品中占比范围2.1%～87.2%，差异较大。底泥和肝胰腺含有共同的优势菌群芽孢杆菌属，芽孢杆菌属也是肠道、鳃的次优势菌群。厚壁菌门的Ruminiclostridium1在肝胰腺(6.5%）、肠道（3.7%）、底泥（1.0%）、鳃（0.3%）中作为主要菌群大量存在。根据5个样品的微生物组成和相对丰度进行物种热图分析（图3），更加直观显示不同样品优势菌群之间差异，鳃和水体优势菌群优势明显。水体中的主要菌群变形菌门的Polynucleobacter、Limnohabitans(6.77%、6.51%），放线菌门的CandidatusLimnoluna(5.59%），变形菌门的OM43clade(3.41%）在其他样品中含量较少。2.4底泥、肝胰腺和肠道菌群根据OTU聚类分析结果，为了直观表现不同样品之间OTU数目组成的相似性及重叠情况，构建韦恩图（图4),5个样品共有248个OTU，占总数8.5%。肠道与肝胰腺、底泥、鳃、水体共有OTU个数分别为1085、1065、607、447，说明肠道与肝胰腺菌群关系最大，肠道菌群受到外界环境中底泥影响最大，底泥、肝胰腺、水体、肠道、鳃独有的OTU分别为637、247、116、108、27。说明底泥菌群更复杂，肠道次之。为了进一步展示样品间物种多样性差异，使用主坐标分析的方法展示各个样品间的差异大小（图5）。在稻虾共作模式下，底泥、肝胰腺、肠道相似度较高，其中肝胰腺和肠道菌群结构相似度最高，水体、鳃与其他样品微生物群落结构相似度较低。3讨论在水产养殖中，水产品体内定植菌群多样性与其功能息息相关，其中的优势菌群更是发挥着决定性的作用，是维护菌群平衡、保持宿主健康的重要因素3.1在水稻联合栽培模式下，细菌群多样性分析通过分析样品Alpha多样性指数可知，稻虾共作模式下，底泥的丰富度和多样性最高，这与拟穴青蟹3.2甲壳类水产品的卫生条件稻虾模式下5个样品菌群主要门类为变形菌门（Proteobacteria）、放