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绿叶素含量是植物生理状态的重要指标，与植物生长发育密切相关。目前,存在多种测定植物叶绿素含量的方法,主要包括传统的Arnon法浒苔作为一种大型绿藻,藻体由一层细胞组成,管状中空1材料和方法1.1酶解藻体(1)实验材料:浒苔样品于2014年6月28日取自青岛近岸漂浮浒苔,先用灭菌海水清洗干净,并在实验室培养3d,实验时挑选未释放孢子、无白化、颜色均匀一致的浒苔藻体。(2)叶绿素提取剂:80%丙酮:用纯丙酮和蒸馏水(8∶2)配成混合液备用。95%乙醇:分析纯。丙酮-乙醇混合液:用纯丙酮和无水乙醇(5∶5)配成混合液备用。丙酮-乙醇水混合液:用纯丙酮、无水乙醇和蒸馏水(4.5∶4.5∶1)配成混合液备用。(3)主要仪器:UV-6100S型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);EppendorfCentrifuge5804R离心机。1.2实验方法1.2.1相关吸收剂提取(1)研磨法将浒苔藻体清洗干净去除污物,用滤纸吸干表面水分备用。用电子天平称取浒苔样品0.1g,共3份,分别放入研钵中,加入2~3mL提取剂,研成均浆,再加提取剂3mL,继续研磨至组织变白,然后转移至50mL具塞离心管中,用少量提取剂冲洗研钵、研棒及残渣一起倒入离心管中,最后用提取剂定容至25mL,摇匀,静止3~5min。在20℃条件下,以6000r/min的转速离心10min,取3mL上清液置于光径1cm的比色杯内。以对应的提取剂为空白对照,在波长663nm、645nm及652nm下测定吸光度,每个样品重复3次(2)浸提法将清洗干净的浒苔藻体用滤纸吸干表面水分,称取0.1g藻体剪碎,长度约2mm左右。然后放入50mL具塞离心管中,加入25mL提取剂,20℃避光浸提,待测。提取液分别在663nm、645nm及652nm下测定吸光度,重复3次。1.2.2提取液用量的确定称取0.1g浒苔藻体,分别用研磨法和浸提法提取叶绿素,分别加入上述4种提取液定容至25mL,每个处理设3个重复。待完全提取后取上清液分别在600~800nm波长范围内扫描吸收光谱,比较吸收光谱间的差异。1.2.3种提取剂和两种提取方法对1.2叶绿素含量的影响采用研磨法和浸泡法提取浒苔叶绿素时,采用上述4种提取液提取叶绿素,分别测定0、0.5、1、2、4、8、16、24h的叶绿素含量变化,比较上述4种提取剂和两种处理方法提取浒苔叶绿素的效果差异。1.2.4不同提取剂的稳定性试验用不同提取剂提取浒苔叶绿素,在20℃生化培养箱中避光放置0、1、2、3、6d后测定提取液中叶绿素含量,比较叶绿素在不同提取剂中的稳定性。1.3测定总色素的含量取3mL叶绿素提取液盛入10mm比色皿中,用提取剂作空白对照,用UV-6100S型紫外可见分光光度计测定645、652、663nm处的光密度值,并根据Arnon公式求得色素的浓度后,再按下式计算组织中单位鲜重的各种色素的含量:2.1叶绿素提取剂为复合溶剂的吸收光谱4种叶绿素提取剂通过研磨法和浸提法提取的浒苔叶绿素在600~800nm范围内的吸收光谱基本相似(图1),说明4种不同叶绿素提取剂的光吸收性质基本相似,可以运用Arnon公式进行叶绿素含量的计算。2.2不同提取剂对胡萨维提取总量的影响虽然,陈福明等2.3乙醇水混合液对叶绿素提取效果的影响黄帆浸提法提取叶绿素速度最快的是95%乙醇,在第3d时叶绿素被完全提取,藻体碎片变白;其次是丙酮乙醇混合液,在第6d时叶绿素基本被完全提取;再次是80%丙酮和丙酮乙醇水混合液,在第9d时提取叶绿素含量才达到最大值。由表2可知,不同叶绿素提取液放置9d后,Chla下降了3.9%~10.9%,Chlb下降了7.5%~21.2%,叶绿素总量下降了5.3%~14.8%。在20℃的黑暗条件下,叶绿素在4种提取液的稳定性均较好,稳定性的大小依次为:80%丙酮>丙酮乙醇混合液>95%乙醇>丙酮乙醇水混合液。虽然,叶绿素的稳定性较差在光照条件下降解较快,但我们的结果表明,在黑暗的条件下,叶绿素的稳定性较好。因此,叶绿素的提取与存放应该注意避光。3酶提取方法(1)4种提取液提取浒苔叶绿素的吸收光谱在600~800nm范围内基本相似,可以采用Arnon公式计算叶绿素含量。(2)通过研磨法和浸提法提取叶绿素比较,采用研磨法提取浒苔叶绿素的提取效率高,在第0h时就能提取95%以上,而采用浸提法提取叶绿素时提取不完全,浸提时间长。(3)4种提取液,其中95%乙醇提取总量少,提取速度较快,稳定性稍差;80%丙酮提取总量多,提取速度稍慢,稳定性好;丙酮乙醇混合液提取总量少,提取速度慢,稳定性较好;丙酮乙醇水混合液提取总量多,提取速度较快,稳定性差。Chla浓度(mg/L):Chla=12.72AChlb浓度(mg/L):Chlb=22.88A叶绿素总浓度(mg/L):Chl(a+b)=Chla+Chlb=20.29A2不同提取方法对于提取叶绿素的影响从叶绿素的提取速度上来看,研磨法要优于浸提法。运用研磨法的4种提取剂在第0h提取浒苔叶绿素含量均能达到完全提取叶绿素含量的95%以上。而采用浸提法的4种提取剂中,提取最快的提取液-95%乙醇在24h后提取叶绿素含