香港海鸥菌实验室诊断技术研究

香港海鸥菌实验室诊断技术研究

香港海胆细菌是2001年首次发现并命名为香港海胆细菌的食源性病原体。该菌株于2001年在香港分离并被称为香港海胆菌。香港海鸥菌可引起社区性肠胃炎和旅行者腹泻,临床表现与沙门菌和空肠弯曲菌引起的病征相似,大部分病人出现水样腹泻2009年1-12月对肇庆市零售市场、超市的草鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼等淡水鱼及胃肠炎腹泻患者进行香港海鸥菌的检测,目前在4种淡水鱼中分离到11株香港海鸥菌;在胃肠炎腹泻患者中分离到1株香港海鸥菌。根据文献报道及香港海鸥菌的生化特性,本实验简化了香港海鸥菌的检测程序,选用氧化酶、触酶及三糖铁(TSI)三项做筛选试验,再用PCR进行确诊,旨在建立本实验室香港海鸥菌的筛选与确诊试验的诊断技术。1材料和方法1.1材料表面1.1.1鱼类样品的采集淡水鱼类标本分别采自肇庆市水产品零售市场、超市,共计92份,包括草鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼,按照无菌采样原则,采集新捕捞的鱼类,置于塑料袋中加水充氧后4~8h内检验。人体粪样标本共计211份,采自肇庆市第一人民医院胃肠炎的腹泻患者,用采样管中的采样棉签,无菌操作条件下采集新鲜粪便后置采样管的Cary-Blair中,于当天送检验室检验。1.1.2麦康凯琼的制备改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)使用北京陆桥技术有限责任公司的干粉配制麦康凯琼脂,临用时加热融化琼脂,加入1%葡萄糖和32mg/L的头孢哌酮(cefoperazone),混合后倾注平板备用。生化鉴定管、氧化酶试购自北京陆桥技术有限责任公司;GNI1.2方法1.2.1棉施工法采集sde和aa平板鱼类样本体表用75%酒精棉球消毒,无菌条件下用剪刀打开腹腔,取出完整的动物肠道,分别剪断动物的中肠和后肠,将棉拭子插入肠道,旋转一圈,采集内容物。采样后的棉拭子直接涂布CMA平板,每个样本涂布2块平板;病人的标本同样也直接涂布2块平板。上述平板均置37℃培养48h。1.2.2生物化学从CMA培养基上挑取无色、透明、扁平、直径在0.5~1.0mm之间的微小菌落进行染色镜检,凡为G1.2.2.普通型菌株的筛选挑取可疑菌落穿刺TSI,37℃培养24h后,TSI反应阴性(仍保持原来颜色)的菌株,再接种精氨酸双水解酶、脲酶生化管及普通琼脂平板,37℃培养24h后,精氨酸双水解酶和脲酶均为阳性的菌株,挑取其普通琼脂平板上的单个菌落进行氧化酶及触酶试验,两项结果都是阳性的菌株,则用VitekGNI1.2.2.香港海鸥菌的筛选挑取可疑菌落进行氧化酶及触酶试验,两项结果都是阳性的则挑取该菌落穿刺TSI,37℃培养24h后,凡TSI反应阴性的菌株,均符合筛选标准,再进行PCR鉴定,经特异性引物PCR检测为阳性的菌株,即可判定为香港海鸥菌菌株。1.2.3pcr对分离菌的鉴定1.2.3.特异性pcr引物设计经GenBank比对确定香港海鸥菌16SrRNA高保守区,应用Primer5.0软件设计特异性PCR鉴定引物,上游序列为:5’-GGCTCAACCTGGGAACTGC-3’,下游序列为:5’-CACCAGAAACCGAAATCTCCAA-3’,扩增片段长度为239bp。用于测序用的16SrRNA的通用引物参考文献1.2.3.模板模板的制备用接种环挑取生化筛选试验符合的菌落若干,于100μl无菌蒸馏水中制备悬液,振荡混匀,水浴煮沸10min,然后冰浴2~5min,10000转/min离心5min,取上清液作为模板。以香港海鸥菌肇庆株LHZQ001模板DNA为阳性对照,并以去离子水为阴性对照。1.2.3.3rc反应系统制剂按照试剂盒推荐的参数配制,反应体积为50μl,10×PCR缓冲液5μl,25mmol/LMgCl1.2.416srna基因搜索取特异性引物PCR阳性的菌株进行16SrRNA基因扩增,方法参照文献2结果2.1香港海鸥菌的分离和鉴定共采集4类淡水鱼,共计92条,分离到香港海鸥菌11株,阳性率为11.96%。其中草鱼51条,分离到香港海鸥菌9株,阳性率为17.65%;鳙鱼16条,分离到香港海鸥菌1株,阳性率为6.25%;鲤鱼24条,分离到香港海鸥菌1株,阳性率为4.17%;鲫鱼1条,未分离到香港海鸥菌。2.2未检出细菌多样性共采集胃肠炎腹泻患者的粪便标本211份,分离到香港海鸥菌1株,阳性率为0.48%,该例患者未检出沙门菌、志贺氏菌和副溶血性弧菌。其主要的临床症状为黄色水样便,腹泻6次/d,不发热,有阵发性腹痛,无呕吐,无里急后重,临床使用喹诺酮类药物治疗有效,服药后2d内停止腹泻。2.3生化反应结果常规生化和筛选生化鉴定均从相同编号的鱼类、人体标本中分离到12株香港海鸥菌,两种方法的符合率为100%,而且这12株香港海鸥菌的生化反应结果均与香港株HKU1相符合,具有革兰氏染色阴性、尿素酶和精氨酸双水解酶阳性、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴性、不能利用枸檬酸盐、不发酵葡萄糖、不溶血、动力活跃等特征。从该12株菌株中选取草鱼分离株LHZQ1,与香港海鸥菌香港株HKU1、肇庆株LHZQ001进行生化特征比较,具体结果见表1。2.4特异性pcr检测结果对氧化酶、触酶与TSI3项生化试验均符合筛选标准的菌株进行特异性PCR检测,共计12株,其中鱼类株11株,人类株1株,结果均为阳性,电泳结果见图1。2.5srrna的序列用ABI3730测序仪对12株分离的香港海鸥菌的16SrRNA进行双向序列测定,去掉重叠区域和引物区,得到的16SrRNA的序列长度在707~946bp之间。将所测序列和GenBank中发布的香港海鸥菌HKU1株进行同源性比较,12株细菌中,有3株DNA序列与香港海鸥菌HKU1株完全同源,有5株与HKU1株仅相差1个碱基,还有4株与HKU1株有2个碱基的差异,同源性达99.5%~100%。3香港海鸥菌的检测目前香港海鸥菌已成为广东淡水鱼输往香港的必检致病菌之一本研究结果显示,肇庆市淡水鱼香港海鸥菌检出率为11.96%,高于广东省的6.76%检测发现,当前测定香港海鸥菌的方法存在着需经全面生化试验后才能排除或确认等缺陷,整个过程繁琐、耗时、费力,不利于快速检测细菌16SrRNA具有高度的保守性,而且具有多拷贝、多信息、长度适中的特点,因此可以作为鉴定细菌菌属的黄金法则综上所述,为更好地开展淡水鱼产品中香港海鸥菌的污染监测,以利于真实地评估香港海鸥菌对食品安全的潜在危险