血液分子生物学检验课件

血液分子生物学检验及流式细胞分析P97第三临床医学院临床检验教研室程真珍2学时血液分子生物学检验及流式细胞分析P97第三临床医学院临床检验教学目的与要求教学目的

掌握主要分子生物学检验技术的原理及方法，以及流式细胞仪的工作原理及数据分析，明确其在血液病诊断、治疗中的应用。教学要求1、掌握：核酸分子杂交技术、PCR技术及流式细胞仪的工作原理及方法。2、熟悉：基因芯片技术、GEP、SNP的工作原理及方法。3、了解：血液分子生物学检验及流式细胞仪在血液病的应用。教学目的与要求教学目的掌握主要分子生物学检验技术的原理及血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等。目前，这些技术在血液学检验领域已得到广泛应用，如应用于血液病基因分析、基因诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小残留病检测等方面。随着分子生物学技术的进一步发展，血液病的基因表达和治疗、细胞之间和细胞内的信号传导、特异的血液病基因或融合基因的检测及应用将成为当代血液分子生物学检验的主要内容和方向。血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术一、核酸分子杂交技术

具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列(单链)一、核酸分子杂交技术探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列DNA—DNA杂交分子DNA—RNA杂交分子DNA分子DNA分子DNA—DNA杂交分子DNA—RNA杂交分子DNSouthern印迹杂交使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由英国人EdwinMellorSouthern于1975年首先设计出来的，故又叫Southernblot。Southern印迹杂交使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸Northern杂交*1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因这种方法与Southernblot杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，被趣称为Northern杂交。Northern杂交*1979年，J.C.Alwine蛋白质印迹(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应蛋白质印迹(Westernbloting)检测蛋白质，即将

印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Souther

核酸原位杂交将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行

荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,

FISH)

是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术，是把生物素或地高辛(DIG)等标记物质标记的DNA片段作为探针（probe），与染色体DNA进行分子杂交，利用荧光色素为检测信号，在荧光显微镜下直接检测探针互补的DNA片段的存在部位。荧光原位杂交探针DNA染色体标本切口平移法前处理探针DNA变性染色体DNA变性单链DNA单链DNA用PI、DAPI对染色体染色荧光原位杂交（FISH）示意图

探针DNA与染色体DNA分子杂交用抗生物素蛋白—荧光素处理找出杂交信号

用荧光显微镜观察生物素（地高辛）标记探针DNA染色体标本切口平移法前处理探针DNA变性染色体DN血液分子生物学检验课件

二、聚合酶链反应技术

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。由于通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。

二、聚合酶链反应技术

聚合酶链反应（polym1.聚合酶链反应技术的原理

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。1.聚合酶链反应技术的原理

PCR技术实际上是在模板DNA、模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7图6-1PCR原理示意图模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变以上为一个循环。在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步,模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2~4min，2~3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。以上为一个循环。在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延2.PCR产物分析(一)电泳方法1．琼脂糖凝胶电泳法（经典）琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同，如表4.1所示：2．聚丙烯酰胺凝胶电泳法（高效分离）表4.2丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围2.PCR产物分析(一)电泳方法表4.1琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围

琼脂糖含量(%)分离线状DNA的有效范围(kb)

0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-2表4.1琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围

琼脂糖含量(表6.2丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺(%)

有效分离范围(bp)溴酚蓝位置(bp)二甲苯蓝位置(bp)3.51000-20001004605.080-500652608.060-4004510012.040-200207015.025-150156020.05-1001245表6.2丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺(%PCR产物分析（二）Southern印迹杂交可提高检测PCR产物的灵敏度（三）斑点杂交法

固相杂交技术，可用于判断产物序列的突变类型和产物的特异性鉴定，有助于血液系统遗传病的基因诊断，基因的多态性分析PCR产物分析（二）Southern印迹杂交PCR产物分析(四)PCR-ELISA引物采用双标记，通过修饰其中一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基团(如生物素)，而通过另一引物的5′端的修饰使产物便于检测，（如地高辛、荧光素等）。本法避免了电泳和杂交的步骤，适用于常规ELISA记数仪检测。极大地提高了灵敏度。PCR产物分析(四)PCR-ELISAPCR产物分析（五）原位杂交法原位杂交（细胞定位）+PCR（高度特异敏感）特点：定性、定量、定位分析（六）实时定量PCR（real-timePCR,RT-PCR）定性定量特点：灵敏度高、特异性强、线性关系好、自动化程度高、操作简单PCR产物分析（五）原位杂交法三、基因芯片技术也叫DNA芯片（DNAchip）是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密度地（点间距<500

m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探针）。这些被固定的分子探针在基质上形成高密度的DNA微阵列，因此，DNA芯片又叫DNA微矩阵（DNAMicroarray）。第一块基因芯片1992年诞生在美国。三、基因芯片技术也叫DNA芯片（DNAchip）基因芯片扫描结果图基因芯片扫描结果图基因芯片技术是建立在Southernblot基础之上的，可以说它是Southernblot的改进和发展，它的原理是：变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。与Southernblot相比较，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自动化的特点。基因芯片技术是建立在Southernblot基础之上的，可

用于基因功能的研究。原理：用不同的荧光染料通过RT-PCR标记不同来源的细胞mRNA制备成探针，将探针混合后与芯片上的基因杂交、洗涤、扫描，得到这些基因在不同组织或个体中的表达谱，再通过计算机分析这些基因在不同组织或个体中的表达差异，得出这些基因表达的重要信息。即：

（1）高表达（2）低表达或不表达1.表达谱基因芯片用于基因功能的研究。原理：用不同的荧光染料通过RT-PCRHBV、HCV、结核杆菌等病原体检测，商检等。2.诊断芯片在DNA和/或RNA水平上用于疾病诊断，如肝癌、糖尿病等。3.检测芯片

HBV、HCV、结核杆菌等病原体检测，商检等。2.诊断芯片在六、单核苷酸多态性分析技术

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。

同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。六、单核苷酸多态性分析技术

单核苷酸多态性（singleSNP的特征

SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.

因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。SNP的特征SNP的检测方法1.传统经典法基于凝胶电泳为基础检测速度慢、灵敏度低、效率低2.高通量检测法主要有DNA芯片技术、变性高效液相色谱、DNA测序技术、飞行质谱仪检测快速、高效、高通量、微型化、自动化SNP的检测方法1.传统经典法七、应用评价1.恶性血液病基因分型及预后判断bcr/abl融合基因：CMLPML-RARa融合基因：APLAML1/ETO融合基因：AML-M2七、应用评价1.恶性血液病基因分型及预后判断应用评价2.免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体(TCR)基因重排的检测3.遗传性血液病的诊断4.HLA基因多态性检测5.肿瘤细胞多药耐药基因的检测6.基因治疗应用评价2.免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体(TCR第七节

流式细胞分析流式细胞仪(FlowCytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。第七节流式细胞分析流式细胞仪(FlowCytometer流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析流路(液流系统）流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计（分析系统）计算机

构造及工作原理流路(液流系统）构造及工作原理流动室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统流动室InjectorFluorescencesignal常用荧光染料介绍FITC：绿色525nmPE：橙黄色575nmECD：橙红色610nmPE－CY5：深红色675nmPerCP：深红色675nmPE－CY7：深红色755nm7AAD：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 488nm波长的氩离子激光激发常用荧光染料介绍FITC：信号散射光信号

FS细胞大小

SS细胞颗粒性荧光信号

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光学系统信号散射光信号光学系统散射光信号——细胞大小及颗粒性FSSS光学系统散射光信号——细胞大小