miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用及其分子机制

miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用及其分子机制

刘治国，李炜，董文婷，张晓东西安国际医学中心医院心脏内科，西安710100脓毒症是一种严重危及生命的疾病，定义为系统性感染并伴有急性器官功能障碍，多器官功能障碍综合征（MODS）被认为是脓毒症的终末状态［1］。尽管MODS根据受影响的器官不同而呈现不同的临床症状，但当伴有心血管并发症时，患者死亡风险可达70%～90%［2］。脓毒症诱发的心肌病是一种可逆性心肌功能障碍，其病理机制是由炎症细胞因子、线粒体功能障碍、局部缺血、内皮素、心肌抑制剂物质上调和抗凝系统激活而造成的心肌损伤［3］。微小RNA（miRNA）是一组小的非编码RNA，通过促进信使RNA（mRNA）降解或阻断mRNA翻译来负调控基因表达。许多miRNA被认为是某些疾病诊断或治疗的生物标志物和可能靶点。研究显示，miR-210的表达在急性心肌梗死、动脉粥样硬化、主动脉狭窄和心力衰竭等心血管疾病中发生改变［4］，且miR-210过表达对这些疾病的靶器官具有保护作用［5］。另有研究发现，miR-210-5p过表达可缓解高氯化钠饮食大鼠心脏的纤维化进展［6］。然而，miR-210-5p在脓毒症心肌损伤中的作用及机制尚未见报道。2022年4月—9月，本研究通过盲肠结扎穿孔术建立脓毒症小鼠模型，观察miR-210-5p在脓毒症心肌损伤中的作用并探讨其机制，旨在为脓毒症所致心肌损伤的治疗提供新的靶点及方向。1材料与方法1.1主要材料清洁级雄性C57BL/6小鼠40只，8周龄，体质量22～25g，购自空军军医大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（军）2007-007号。肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTnI）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；超氧化物阴离子荧光探针（DHE）购自美国Invitrogen公司；TUNEL检测试剂盒购自瑞士Roche公司；过氧化物酶（MPO）、剪切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleavedCaspase-3）、沉默调节蛋白1（SIRT1）、叉头框蛋白O1（FOXO1）、乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1）、核因子κB亚基p65（NF-κBp65）、乙酰化NF-κBp65（Ac-NF-κBp65）及GAPDH抗体均购自美国Abcam公司，羊抗兔、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司，miR-210-5p、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）及内参U6、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司构建。1.2动物建模及分组处理将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、脓毒症组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组、脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组，每组10只。除对照组外均采用盲肠结扎穿孔术建立小鼠脓毒症模型［7］。操作步骤：小鼠用2%的异氟烷麻醉后腹部脱毛，在腹部皮肤组织中线垂直切口2～3cm，打开腹膜进入腹腔。将位于腹部左侧的盲肠小心拉出，并将粪便内容物挤向盲袋。距盲肠末端1cm用丝线结扎回盲瓣远端盲肠组织，使用18号针，在盲肠上进行两次穿透性穿刺。为了确认穿刺针穿刺成功，在还纳腹腔之前，将少量粪便从盲肠通过穿刺孔暴露出来。使用6.0丝线缝合腹膜及皮肤，然后腹腔注射预热生理盐水（0.05mL/g）进行复苏。对照组小鼠采用不结扎、不穿刺的剖腹手术进行对照。脓毒症+miR-210-5p激动剂组、脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组小鼠在建模前1d及建模术后即刻分别经尾静脉注射10nmol/L的miR-210-5p激动剂agomir及miR-210-5p拮抗剂antagomir，对照组和脓毒症组在相同时间经尾静脉注射等体积生理盐水。1.3miR-210-5p对脓毒症小鼠心功能的调控作用观察采用超声心动图。小鼠经2%异氟烷麻醉后，剔除胸前毛发，置于恒温操作台。使用Vevo770超声心动图系统经胸超声心动图评价小鼠左心室功能的变化，在长轴和短轴视图下分别获得二维和M模式图像。对每只小鼠采集3个独立心动周期的图像，测量左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS），以此评价左心室收缩功能。1.4miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用观察1.4.1心肌组织病理改变采用HE染色。各组心功能检查后处死，取出心脏，采集部分心脏样本，在4%的多聚甲醛中固定过夜，脱水，石蜡包埋，切成5μm的切片。脱蜡后，心肌组织切片在分级乙醇溶液中复水，用苏木精和伊红染色，光镜下观察心肌组织病理改变。1.4.2血清心肌损伤标志物CK-MB、cTnI采用比色法。各组小鼠处死后，颈动脉留取1mL血样，静置离心后获得上层血清，采用比色法严格按照试剂盒说明书测定小鼠血清CK-MB、cTnI水平。1.5miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织细胞凋亡的调控作用观察1.5.1细胞凋亡率采用TUNEL染色。将“1.4.1”制备好的心脏石蜡脱蜡并在分级乙醇溶液中复水，使用TUNEL凋亡检测试剂盒对细胞进行染色分析。通过末端脱氧核苷基转移酶dUTP切口末端标记反应检测到凋亡细胞显示为绿色，通过DAPI染液染色所有细胞的细胞核显示为蓝色，使用激光共聚焦显微镜观察并获取图像。凋亡率以凋亡细胞数（绿色）/计数细胞总数（蓝色）×100%表示。1.5.2凋亡蛋白cleavedCaspase-3采用Westernblotting法。取各组心脏组织，用裂解缓冲液提取蛋白质，用BCA法测定总蛋白浓度。用SDS分离蛋白质并转移到PVDF膜上。分别加入cleavedCaspase-3及GAPDH（1∶1000）一抗孵育膜过夜，用山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（1∶5000）二抗孵育膜。使用Bio-Rad成像系统检测条带，以GAPDH为内参对蛋白进行半定量分析，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。1.6miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织炎症反应的调控作用观察1.6.1中性粒细胞浸润采用免疫组化染色将“1.4.1”制备好的心脏石蜡脱蜡并在梯度级乙醇溶液中复水，用3%H2O2在室温下作用10min，抑制内源性过氧化物酶活性。切片用5%山羊血清阻断30min，使用抗MPO一抗（1∶200）在4℃下孵育过夜。洗涤后继续将切片与山羊抗兔IgG二抗在37℃孵育30min。干燥后，用中性胶固定切片，在显微镜下观察中心粒细胞浸润情况，以MPO免疫组化染色相对表达强度反映心肌组织中性粒细胞浸润程度。1.6.2炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1采用实时荧光定量PCR法。各组心功能检查后处死，取出心脏，采集部分心肌组织样本，TRIzol试剂提取心肌组织样本中总RNA，根据PrimeScript™RTMasterMix的说明书，使用随机引物从RNA中反转录提取cDNA，所有cDNA在使用前保存在-80℃。引物序列：TNF-α正向引物5'-ACTCCAGGCGGTGCCTATG-3'，反向引物5'-GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3'；IL-1β正向引物5'-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3'，反向引物5'-TGCCACCTTTTGA-CAGTGATG-3'；IL-6正向引物5'-TGATGGATGCTACCAAACTGGA-3'，反向引物5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；MCP-1正向引物5'-TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA-3'，反向引物5'-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3'；GAPDH正向引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反向引物5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'。反应条件：94℃、5min，94℃、10s，60℃、20s，72℃、30s，重复扩增40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1相对表达量。1.7miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织氧化应激水平的调控作用观察1.7.1抗氧化物SOD、GSH、GSH-Px采用比色法。取各组小鼠左室心肌组织10mg，充分研磨后均质于测定缓冲液中，严格按照试剂盒说明书测定心肌组织中抗氧化物SOD、GSH和GSH-Px表达。1.7.2过氧化物MDA采用比色法。方法同“1.7.1”，严格按照试剂盒说明书测定心肌组织过氧化物MDA表达。1.7.3活性氧（ROS）生成采用DHE染色。取小鼠左心室心脏标本经液氮速冻后切成10μm厚的冰冻切片，滴加DHE染液反应30min，使用激光共聚焦显微镜观察并获取图像，用ImageJ软件分析结果，以DHE荧光强度表示心肌组织ROS生成情况。1.8miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织SIRT1通路相关蛋白的调控作用观察1.8.1SIRT1蛋白采用Westernblotting法。取各组小鼠心脏组织，转膜后加入SIRT1、GAPDH一抗（1∶1000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH为内参，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。1.8.2FOXO1、NF-κBp65乙酰化程度采用Westernblotting法。取各组小鼠心脏组织，转膜后加入FOXO1、Ac-FOXO1、NF-κBp65、Ac-NF-κBp65及GAPDH一抗（1∶1000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH为内参，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量，以Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κBp65/NF-κBp65反映FOXO1、NF-κBp65乙酰化程度。1.9统计学方法采用GraphPadPrism统计软件。计量资料通过SampleK-S进行正态检验，符合正态分布的以±s表示，组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1miR-210-5p对脓毒症小鼠心功能的调控作用小鼠LVEF、LVFS对照组＞脓毒症+miR-210-5p激动剂组＞脓毒症组＞脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表1。表1各组小鼠LVEF、LVFS比较（±s）表1各组小鼠LVEF、LVFS比较（±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010LVEF（%）71.45±4.2244.94±4.42*62.79±4.41*#33.14±4.20*#LVFS（%）33.88±2.7221.12±2.85*28.72±2.81*#14.44±2.69*#2.2miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌损伤的调控作用HE染色显示，对照组小鼠心肌呈束状分布，间质紧密，心肌细胞排列有序；脓毒症组小鼠心肌束断裂明显，心肌间质疏松，心肌细胞排列紊乱；脓毒症+miR-210-5p激动剂组较脓毒症组小鼠心肌组织病理改变明显改善；脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组较脓毒症组小鼠心肌组织病理损伤更加显著（OSID码图1）。小鼠血清CK-MB、cTnI水平对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表2。表2各组小鼠血清CK-MB、cTnI水平比较（U/L，±s）表2各组小鼠血清CK-MB、cTnI水平比较（U/L，±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010CK-MB970.91±176.101470.09±210.91*1037.35±157.45#1962.17±187.13*#cTnI334.07±60.57722.69±73.09*398.69±58.24#862.29±53.56*#2.3miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织细胞凋亡的调控作用小鼠心肌细胞凋亡率对照组＜脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组，cleavedCaspase-3蛋白对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表3。表3各组小鼠心肌细胞凋亡率、cleavedCaspase-3蛋白比较（±s）表3各组小鼠心肌细胞凋亡率、cleavedCaspase-3蛋白比较（±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010心肌细胞凋亡率（%）0.98±0.529.49±1.43*4.14±1.01*#15.38±1.69*#cleavedCaspase-31.02±0.182.02±0.22*1.17±0.19#2.44±0.16*#2.4miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织炎症反应的调控作用小鼠心肌组织MPO活性及TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表4。表4各组小鼠心肌细胞MPO活性及TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1比较（±s）表4各组小鼠心肌细胞MPO活性及TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1比较（±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010MPO0.93±0.192.70±0.27*1.49±0.19*#3.34±0.45*#IL-1β1.03±0.152.53±0.22*1.32±0.17#2.98±0.23*#IL-60.97±0.133.02±0.27*1.35±0.21#3.82±0.36*#TNF-α0.94±0.192.43±0.22*1.39±0.21*#3.14±0.25*#MCP-11.03±0.213.04±0.38*1.48±0.25#3.80±0.33*#2.5miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织氧化应激水平的调控作用小鼠心肌组织SOD、GSH、GSH-Px对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＞脓毒症组＞脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组，心肌组织MDA、DHE荧光强度对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表5。表5各组小鼠心肌细胞SOD、GSH、GSH-Px、MDA及DHE荧光强度比较（±s）表5各组小鼠心肌细胞SOD、GSH、GSH-Px、MDA及DHE荧光强度比较（±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010SOD（U/mg）73.40±4.3951.92±5.35*68.34±4.25#39.34±6.57*#GSH（mg/g）5.84±0.423.92±0.37*5.07±0.35#2.80±0.49*#GSH-Px（U/mg）1629.12±102.781009.26±123.64*1494.42±108.55#779.37±115.68*#MDA（nmol/mg）1.58±0.303.14±0.26*1.92±0.18#4.06±0.33*#DHE荧光强度0.94±0.142.61±0.19*1.42±0.21*#3.21±0.35*#2.6miR-210-5p对脓毒症小鼠心肌组织SIRT1通路相关蛋白的调控作用小鼠心肌组织SIRT1蛋白表达对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＞脓毒症组＞脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05），Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κBp65/NF-κBp65对照组、脓毒症+miR-210-5p激动剂组＜脓毒症组＜脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组（P均＜0.05）。见表6。表6各组小鼠心肌细胞SIRT1蛋白及Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κBp65/NF-κBp65比较（±s）表6各组小鼠心肌细胞SIRT1蛋白及Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κBp65/NF-κBp65比较（±s）注：与对照组比较，*P＜0.05；与脓毒症组比较，#P＜0.05。组别对照组脓毒症组脓毒症+miR-210-5p激动剂组脓毒症+miR-210-5p拮抗剂组n10101010SIRT11.04±0.150.50±0.11*0.94±0.14#0.25±0.09*#Ac-FOXO1/FOXO10.98±0.193.22±0.34*1.29±0.24#4.08±0.31*#Ac-NF-κBp65/NF-κBp651.01±0.112.45±0.29*1.22±0.15#3.21±0.28*#3讨论脓毒症由感染引起，可导致危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房患者死亡的主要原因之一［1］。临床和基础研究表明，心脏是脓毒症所致多器官功能障碍的主要靶器官，心肌功能障碍进一步促进了脓毒症的恶化和发展，严重影响脓毒症患者的预后［2，8］。尽管对脓毒症的研究已持续多年，但其发病率及病死率并没有随着时间的推移而降低，并且脓毒症所致心肌损伤的确切机制尚未完全阐明。炎症反应是脓毒症的一个最主要特征。大量证据表明，炎症反应参与了脓毒症介导的心肌损伤的发生发展［9］。IL-6、TNF-α、IL-10和IL-1β等促炎因子水平已被证明与脓毒症诱导的心肌损伤严重程度密切相关［10］。同时，炎症因子还可以激活中性粒细胞等其他炎症细胞，进而触发炎症级联反应［11］。因此，中性粒细胞浸润是脓毒症引起心肌功能障碍的另一个相关因素。由于抗炎反应在脓毒症相关器官损伤发病机制中的重要作用，因而减轻炎症反应成为脓毒症治疗及改善心脏功能障碍的重要策略。此外，研究显示，由炎症反应引起的氧化应激可导致脂质过氧化、DNA损伤和线粒体功能恶化［12］。氧化应激被定义为活性氧（ROS）水平升高和抗氧化机制减弱之间的不平衡。线粒体损伤导致ROS产生过多，ROS诱导的心肌细胞氧化应激促进蛋白质氧化和脂质过氧化，从而降低心肌细胞的收缩力，影响心脏泵血功能，导致远处器官或组织低灌注［13］，甚至通过凋亡和坏死触发心肌细胞死亡［14］。因此，抑制氧化应激对于减轻脓毒症心肌损伤同样重要。越来越多的证据表明，miRNA参与了多种病理生理过程，可能是心血管疾病诊断和预后的生物标志物或治疗靶点。其中，miR-210的表达在急性心肌梗死、动脉粥样硬化、主动脉狭窄和心力衰竭等心血管疾病中均发生改变［5］。WANG等［15］发现，上调miR-210可促进急性心肌梗死大鼠的心肌血管生成。BIAN等［16］研究显示，miR-210过表达可减轻氧葡萄糖剥夺/再灌注诱导的心肌细胞损伤，而miR-210表达减少可加重心肌细胞凋亡。此外，ZHAO等［6］观察到miR-210-5p过表达可缓解高氯化钠饮食大鼠的心脏纤维化进展。我们的研究结果显示，脓毒症小鼠心肌组织中miR-210-5p水平显著降低，使用miR-210-5p激动剂agomir后可明显提高脓毒症小鼠心肌组织中miR