五发酵动力学

研究目的：①进行最佳发酵工艺条件的优选和控制，如发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数；②根据发酵动力学模型来设计程序，模拟最合适的工艺流程和发酵工艺参数，使生产控制达到自动化和最佳化；③为试验工厂数据的放大和分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据。第1页/共85页第一节微生物生长代谢过程中的质量平衡一、微生物反应(生长代谢)过程中的碳平衡微生物反应通式：碳源＋氮源＋O2→菌体＋产物＋CO2+H2O微生物代谢的化学分子反应可表示为：CHmOn+aNH3+bO2→Yc·CHxOyNz+Ycp·CHuOvNw+(1-Yc-Ycp)CO2+dH2OYc：是与碳相关的菌体得率，Ycp：是与碳相关的代调产物的得率。第2页/共85页根据反应平衡原理有：a＝Yc·z+Ycp·wb＝(1-Yc-Ycp+m/4-n/2)+(Ycp/4)·(2v+3w-u)+(Yc/4)(2y+3z-x)d＝m/2+(Ycp/2)(3w-u)+(Yc/2)(3z-x)10-2式第3页/共85页1、最低培养基与完全培养基

(1)二者的概念；最低培养基：培养基是由单一碳源葡萄糖与无机盐组成，葡萄糖在微生物生长过程即作为生长所需能源，又作为构成菌体的材料完全培养基：在培养基内不但含有碳源和无机盐，还含有构成菌体所需的材料，如酵母膏等

(2)微生物对两种培养基的用途不同。第4页/共85页第5页/共85页第6页/共85页2、代谢过程中基质和产物之间的C素平衡根据基质的变化情况可建立如下平衡关系：

CS=CX+CP+CCO2如果用α1、α2、α3、α4表示基质、菌体、CO2、产物中碳的含量(g碳/mol)

则，上述平衡也可表示为：第7页/共85页（微生物的基质消耗比速）（微生物的生长比速）（微生物的CO2生成比速）（微生物的产物生成比速）若定义：则，上式可简化为：第8页/共85页由上式可以判断代谢途径：此值接近1，说明估计途径基本正确；小于0.6，则途径有误差。第9页/共85页3、微生物生长过程中的主要基质——碳平衡在以糖为碳源的生长过程中，消耗的碳(△S)主要用来：(1)满足菌体生长(个体增加)的需要，(△S)G；(2)维持菌体生存(能量)的消耗，(△S)m

；(3)转变为代谢产物所消耗，(△S)P

；则可表示为：第10页/共85页若用YG—表示用于微生物生长的部分碳源对菌体的得率常数；m—表示微生物的碳源维持常数；YP

—表示用于微生物产物合成部分碳源对代谢产物的得率常数；则有第11页/共85页所以：-------------式（10-7）在以细胞为目的产物的发酵生产中，如果忽略代谢产物的量，则有：第12页/共85页mμ(h-1)YG－1用μ对ν作图，得直线，可求得维持常数m，用于微生物生长的碳源对菌体的得率常数YG的倒数。如下图所示：第13页/共85页若定义YX/S为基质对菌体的得率，即：则：而：⇒第14页/共85页即有：用μ-1对作图，也得直线。YG－1斜率＝mμ-1第15页/共85页4、细胞物质生产过程中碳源的化学平衡

YG越接近YX/S，说明碳源转化为菌体的效率越高。注意理解YX/S与YG的区别5、微生物生长过程中进行碳衡算的意义(1)为提高生产水平提供依据。(2)为建立发酵动力学模型奠定基础。(3)为探求X的代谢调控方式打下基础。第16页/共85页二、生长代谢过程中的ATP循环与氧平衡1、ATP循环合成代谢分解代谢维持代谢ATPADP繁殖第17页/共85页第18页/共85页2、ATP的产生——生物氧化底物水平磷酸化(获得能量少)

电子传递水平磷酸化(获得能量多)第19页/共85页底物水平磷酸化第20页/共85页H2OPi底物水平磷酸化第21页/共85页NADH呼吸链H2O12O2O2-MH2还原型代谢底物FMNFMNH2CoQH2CoQNAD+NADH+H+2Fe2+2Fe3+细胞色素b-c-c1-aa3

FeS2H+M氧化型代谢底物FADH2呼吸链FADFADH2琥珀酸

FeS2Fe2+2Fe3+细胞色素b-c1-c-aa3CoQH2CoQ12O2O2-2H+H2O延胡索酸第22页/共85页3、微生物生长代谢过程中的氧平衡根据单一碳源培养基内，可建立下列平衡：

A(-△S)=B(△X)+C(△P)+(△O2)式中：A、B、C分别为对应物质完全氧化时的需氧量.△O2

为微生物生长代谢的耗氧量由此可得到M培养时氧平衡式为（假设没有产物生成）：即：-------------式（10-10）第23页/共85页△O2单位时间内维持生命活动的耗氧：m0X△t生长菌体的耗氧：△X/YGOYGO用于菌体生长的氧对菌体的得率则有：△O2＝m0X△t＋△X/YGO-----（10-11）根据定义并结合10-11式，有：-------------式（10-12）X第24页/共85页m0μ(h-1)YGO－1当：由实验求得微生物的某一生长比速μ对其所对应的耗氧比速Qo2作图时，可得到一直线(如下图所示)，可确定相应的参数mo和1/YGO。第25页/共85页-------------式（10-7）-------------式（10-13）同时，前面可知第26页/共85页由（10-13）和（10-7）式可得有：第27页/共85页第二节微生物生长数学模型的建立酶反应服从米氏方程：第28页/共85页微生物葡萄糖的比消耗速率与限制性底物浓度的关系也类似于米氏方程，即：式中：νmax—葡萄糖最大的消耗比速；

KS—饱和常数；式(1)研究发现：微生物连续培养过程以葡萄糖作为限制性基质，其浓度的倒数1/[S]与葡萄糖比消耗速率的倒数1/ν呈线性关系；葡萄糖浓度[S]与其比消耗速率v的关系呈饱和曲线。第29页/共85页由基质消耗对细胞得率YX/S定义：有：根据μ的定义有：第30页/共85页该式就是Monod方程，式中：μmax：最大比生长速率(h-1)。KS：为饱和常数，表示菌体对基质的亲和力的大小。[S]：限制性基质浓度第31页/共85页Monod式的生物学意义：1、μmax、KS：

(1)特定M，确定培养条件，μmax、KS是定值，体现M的特性;(2)不同M，μmax、KS不同，但：μmax变化小，而KS变化大。

(3)同种M，在不同S中，μmax、KS值不同。KS↑,亲和力↓，M对基质越不敏感；反之亲和力大，敏感。（4）KS数值上等于生长比速达到最大生长比速一半时的基质浓度第32页/共85页

KS越大，表示微生物对营养物质的吸引亲和力越小，反之越大。对于许多微生物来说，KS值是很小的，一般为0.1~120mg/l或0.01~3.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。第33页/共85页2、S浓度变化对μ的影响(1)S很小(S<<KS)时，S＋KS≈KS，(2)当S增大，μ与S渐不成正比；，μ与S成正比。(3)当(S>>KS)时，KS＋S≈S,μ=μmax。第34页/共85页限制性基质浓度与微生物生长比速之间的关系第35页/共85页斜率Monod方程式双倒数图第36页/共85页微生物生长的发酵过程，同样存在抑制作用。竞争性抑制：非竞争性抑制：第37页/共85页第三节微生物发酵动力学一般说来，M生长培养和发酵方式有分批发酵：底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反应，经过一定时间后将全部反应系取出。连续发酵：反应开始后，一方面把底物连续地供给到反应器中，另一方面又把反应液连续不断地取出，使反应条件不随时间变化。补料发酵:是指先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性底物送入反应器，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，反应终止取出反应体系。第38页/共85页一、微生物分批发酵生长动力学1、分批发酵的不同阶段：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：指数生长期:减速期:静止期：衰亡期:第39页/共85页

(1)

停滞期停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。接种物的生理状态和浓度影响停滞期的长短。解决途径：一是尽量选择处于指数生长期的种子。二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。第40页/共85页

(2)对数生长期处于对数生长期的微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数目或质量的增加维持稳定，并达到最大值。此时，如以细胞数目或生物质量的对数值对培养时图，将得一直线，该直线的斜率就等于μ。第41页/共85页细胞浓度增长一倍所需时间称为倍增时间(doublingtime)或增代时间(generationtime)，

微生物细胞的倍增时间较短。细菌一般为0.25-1h，酵母菌约为1.15-2h;霉菌约为2-6.9h；

动植物细胞的倍增时间较长，如哺乳动物细胞的td一般为15-100h；植物细胞约为24-74h。第42页/共85页例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)63364153221μ(h-1)0.060.240.430.660.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，Ks和td?解：将数据整理：S/μ100137.5192.5231.8311.3S63364153221第43页/共85页μmax，＝1.11(h-1);Ks＝97.6mg/Ltd＝ln2/μmax＝0.624h第44页/共85页微生物的最大比生长速率在工业上的意义为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关。限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度，而是营养物质进入细胞的速度。第45页/共85页

(3)稳定期在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本不变；但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。第46页/共85页

(4)衰亡期在衰亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞开始死亡。在发酵工业生产中．在进入衰亡期之前应及时将发酵液放罐处理。第47页/共85页2、微生物生长速度的动力学方程比生长速率受限制性基质浓度的影响。二者之间的关系由Monod式描述：当存在多种限制性营养基质时，方程可改为:如果所有营养物过量，也无抑制性因素时，细胞生长可处于对数生长期，可达到μ=μmax。第48页/共85页二、营养利用和产物生成动力学1.反应速度方程式的推导F,S0,X0V,S,X，PF',S,X,PF,F’：基质流量(L/h)；X：细胞浓度(g菌体/L)；V：发酵液体积(L);S0：流入基质浓度(g基质/L)S：流出基质浓度(g基质/L)YX/S：基质的菌体得率(g菌体/g基质)YP/S：基质的产物得率(g产物/g基质)QP：比产物生成速率(g产物/g菌体.h)P：发酵液中产物浓度(g产物/L);第49页/共85页根据体系物料平衡原理有：(1)菌体增长：(2)限制性基质消耗（3）产物生成第50页/共85页菌体浓度变化：产物浓度变化：对于分批发酵，F，F’＝0，考虑产物不分解，则分批发酵动力学为：第51页/共85页二、补料分批培养间歇补料操作连续补料操作按操作方式高底物浓度的优缺点提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。第52页/共85页1、单一补料分批培养所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。特点由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。分批补料系统不向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。第53页/共85页流加发酵反应器中细胞、基质和产物总量的变化速率：第54页/共85页细胞总量的变化率如果进行恒速流量为F，则设同理可得基质和产物浓度的变化率第55页/共85页随着培养基的流加，细胞浓度逐渐增大，限制性基质浓度逐渐减小，最后限制性基质浓度趋向零，而细胞浓度则趋于定值,dS/dt=0，dX/dt≈0,进入拟稳态。这时μ≈D。

连续补料分批培养数属半恒稳状态（拟稳态），与恒稳状态μ＝D不同。在半恒稳状态下有：因培养液体积在逐渐增大，所以稀释率和比生长速率渐渐减小。

第56页/共85页2、补料分批培养应用：

以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；

采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器中，使发酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代谢物的积累，从而可以有效去阻遏。1）细胞的高密度培养

一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底物浓度会抑制菌体的生长；

采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很高的程度，如大肠杆菌浓度可达145g/L。2）发生底物抑制的过程一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。3）分解代谢物阻遏4）营养缺陷型菌株的培养

一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需；但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，有助于提高产物的生产。5）前体的补充

在一些发酵过程中，加入前体可使产物的生产大大增加；

但许多前体对菌体有毒性；

通过补料加入前体既满足产物合成的需要，又不使前体大量积累而产生抑制作用。第57页/共85页(一)连续培养设备类型均匀混合反应器恒化器恒浊器连续培养设备活塞流反应器

1．均匀混合的生物反应器在这种反应器中，培养基经搅拌而混合均匀，反应器中的各部分培养基间不存在浓度梯度。操作：对数期后期，以一定的速度流进新鲜培养基，同时以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡。

三、连续培养第58页/共85页(1)恒化器

是一种使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。称为外控制式的连续培养装置，通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的稳态连续培养。这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却保持稳定菌体密度的菌体。在恒化器中，一方面菌体密度会随时间增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。第59页/共85页第60页/共85页(2)恒浊器是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。可称为内控制式的连续培养装置，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。第61页/共85页群体生长速率与临界底物浓度的关系第62页/共85页恒浊器与恒化器的比较装置控制对象培养基培养基流速恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定第63页/共85页

2，活塞流反应器这是一种不均一的管状反应器，培养基由反应器的一端流入，而从另一端流出。在这种反应器中，没有返混现象，因而，反应器内的培养基呈极化状态，在其不同的部位，营养物的成分、细胞数目、传质效果、氧供应和生产量都不相同。对于这类反应器，在其入口处，加入物料的同时也必须加入微生物细胞。通常是在反应器的出口处装一支路，使细胞返回，也可以来自另一连续培养装置(种子供应系统)。第64页/共85页管道非均匀混合连续发酵第65页/共85页连续培养的优点：1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。第66页/共85页连续培养在生产上的应用还很有限的原因①许多方法只能连续运转20一200小时，而工业系统则要求必须能稳定运行500一1000小时以上；②工业生产规模长时间保持无菌状态有一定困难；③连续培养所用培养基的组成要保持相对稳定，这样才能取得最大产量，而工业培养基的组成成分，如玉米浆、蛋白胨和淀粉等，在批与批之间有时会出现较大变化；④当使用高产菌株进行生产时，回复突变可能发生。在连续培养过程中，回复突变的菌株有可能会取代生产菌株而成为优势菌株。⑤对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利用率较低，往往造成生产成本的增加。第67页/共85页（二）连续发酵动力学物料衡算积累速率＝流入速率-流出速率-反应消耗速率S：限制性底物浓度（g/L）X：菌体浓度（g/L）P：产物浓度（g/L）V：培养液体积（L）F：培养基体积流率（L/h）假定：培养(发酵)是在理想状态下进行。(1)物料进罐就混合均匀；(2)罐内无菌体死亡；F,S0,X0V,S,X,PF,S,X,P第68页/共85页1、细胞衡算：对于连续发酵系统，细胞平衡为：在流加新鲜培养基和忽略细胞死亡的情况下，则有：流量与培养液体积之比称为稀释率，用D(1/时间)表示：第69页/共85页要使连续系统稳定运行，必有：

μ是一个表示M性质的参数；

D是一个操作参数；单罐连续培养：在一定范围内，人为调节培养基的流加速率，可以使细胞按所希望的比生长速率来生长。第70页/共85页2、限制性基质物料平衡稳定状态时，系统内：在这种情况下，细胞浓度为：+第71页/共85页2、限制性基质物料平衡细胞浓度为：由Monod式可知：第72页/共85页3、产物衡算恒稳状态时：则有：第73页/共85页Dc：流出液中的基质浓度与流入液流中的基质浓度相等时的最小稀释率（S=S0）。此时可能达到的比生长速率μ，

当D>Dc时，稀释率超出临界稀释率，细胞的生长速率跟不上稀释速率，反应器中的细胞浓度不断降低，最后细胞从反应器中被洗出(washout)。

当D<Dc时，反应器中限制性基质的稳态浓度S：4、临界稀释速率第74页/共85页连续培