灭活方法对冰核活性细菌活性的影响

灭活方法对冰核活性细菌活性的影响

自1973年首次报道冰核活性细菌（简称ia）以来。1材料和方法1.1材料表面1.1.1rbicola培养模式草生欧文氏菌10025A(Erwiniaherbicola)来源于中国林业科学院森林保护研究所。Xanthomonascampestris206菌株,本实验室从天津市地区蔬菜叶表分离。1.1.2培养基MPDA培养基见文献1.1.3超声波细胞粉碎机HYG-Ш型回转式恒温调速摇瓶柜,JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机,J2-21型低温冷冻离心机,HC21006型低温恒温器,玻璃组织研磨器,721分光光度计等。1.2方法1.2.1实验方法1.2.1.mpda液体培养基将活化后的冰核活性细菌10025A斜面菌种接入到30mlMPDA液体培养基中再活化一代后,按2%的接种量接种到MPDA液体培养基中,在31℃,180r/min的条件下摇床培养24h后转至18℃下继续培养2h。将培养物在4000r/min下低温离心30min,磷酸缓冲液(50mmol/L,pH=7.0)洗涤两次后按一定体积悬浮,测定细菌悬液细胞浓度和冰核活性。1.2.1.细菌悬液处理及活菌计数和冻滴率的测定将含有30ml菌悬液的小烧杯置于冰浴中,超声波输出功率为400W、超声时间2s,间隙时间2s,设计不同的细菌悬液浓度和总的超声处理时间,定时取样进行显微镜观察并进行活菌计数和冻滴率的测定。1.2.1.3-辐射处理按前述方法制备细菌悬液后,分别将70ml细菌悬液置于无菌三角瓶中,包扎好后送到天津市物理所辐照中心进行辐射处理,采用的辐射源为1.2.1.超声波配合处理按前述方法制得细菌悬液后离心,菌体重新悬浮于溶菌酶浓度为1mg/ml的0.001mol/L的磷酸缓冲液(含0.001mol/LEDTA,0.25mol/L蔗糖)中,28℃下静置2h,然后激烈震荡或置于超声波中配合超声波进行处理,然后进行活菌计数和冻滴率的测定。1.2.1.活菌计数和冻滴率的测定将细菌悬液置于冰箱冷冻室中(-18℃)冻结24h后取出,室温下缓慢解冻,无菌操作吸取2ml用于活菌计数和冻滴率的测定,其余继续冻结24h后进行活菌计数和冻滴率的测定。1.2.1.活菌计数和冻滴率的测定将一定体积得到的湿菌体移入研磨器中,加入2g石英沙,研磨30min后用一定体积的磷酸缓冲液洗出菌体并悬浮,进行活菌计数和冻滴率的测定。1.2.2测量1.2.2.1.冷冻率的测量采用Lindow改进的小液滴法1.2.2.2.活细菌计算方法在MPDA平板上采用倾注法测定冰核细菌数2结果与讨论2.1超声破裂法对冰核细菌的死亡和冰核活性的影响2.1.1超声处理时间对1005a冰核菌的死亡率和冰核活性的影响超声波辐射时间是影响细菌细胞破碎死亡效果的重要因素。本实验研究了细胞浓度为1.4×102.1.2超声处理中的细胞浓度对10025a的死亡率和冰核活性的影响选取不同细胞浓度的菌液(1.4×102.1.3声波法处理由于溶菌酶可以使细菌细胞壁水解,导致细胞壁疏松或细胞破碎。因此采用溶菌酶配合超声波法处理冰核细菌,以期获得更高的死亡率。结果见图5,该方法使细菌死亡率提高到99.11%,溶菌酶的加入虽然对冰核活性影响不大(见表2,溶菌酶法),但并未使死亡率达到100%的效果,成本的增加大于效果的提高,不太适合实际应用。2.2辐射处理对冰核细菌死亡率和冰核活性的影响溶菌酶法、研磨法和冻融法对冰核细菌死亡率和冰核活性的影响结果见表1。溶菌酶法可使细菌死亡率达到90.7%,研磨法和冻融法的细菌死亡率相对都较低,冻融法还造成冻滴率的显著下降,可见上述方法均不可取。采用辐射法对前面所用冰核细菌10025A和另一株具冰核活性的黄单胞菌属的206菌株进行灭活处理,考察辐射处理对冰核细菌死亡率和冰核活性的影响,结果见表2。冰核细菌10025A两种菌悬液经过20kGy辐射剂量的照射后细菌全部死亡,样品液在平板上培养几天仍无菌生长,样品液的冻滴率稍有下降。提高剂量到25kGy以上时,辐射后的原处理液冰核活性极度下降,OD600nm值为0.1的稀释液的冰核活性为零。206菌株的两种菌悬液经过25kGy辐射剂量照射后,在计数培养的第1d天没有生长,第2d开始有大量菌生长。因辐射作用机制主要是使微生物DNA受损,从而使细胞丧失繁殖能力,但206菌株对DNA受损有很强的修复能力,所以表现出上述特性,这与有关文献报道3辐射处理对冰核细菌死亡率的影响探讨了几种灭活方法对冰核活性细菌死亡率和冰核活性的影响,结果表明:超声波破碎法可以使冰核细菌10025A死亡率达到98%以上,但冰核活性也有所下降。辐射处理可使冰核细菌达到100%的死亡率,不同菌种对辐射的敏感程度不同,冰核活性的变化也有所不同,冰核细菌10025A在20kGy辐射剂量下100%