spo0a基因缺失对bclausii发酵生产性能的影响

spo0a基因缺失对bclausii发酵生产性能的影响

克林威治转化菌是一种厌氧菌，具有良好的耐药性，可以在极端环境中生长。近年来,芽孢形成及萌发过程中关键基因的研究目前国内外研究发现,spo0A基因缺失对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、梭状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)等多种芽孢杆菌的芽孢生成均产生有效的抑制作用1材料和方法1.1材料和试剂1.1.1siiql-1质粒及ph值1的水siiql-1hta1克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)QL-1、含pHT01质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109:山东省微生物工程重点实验室保存。1.1.2试剂与试剂盒限制性核酸内切酶:大连TakaRa公司;氯霉素、Ezup柱式基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒:生工生物工程(上海)有限公司;高纯度质粒小量快速抽提试剂盒:北京艾德莱生物科技有限公司;其他试剂均属于国产分析纯。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。1.1.3蛋白/淀粉法LB培养基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、pH7.0。可溶性淀粉培养基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、可溶性淀粉2g/L、pH7.0~7.2、琼脂20g/L。菌体增殖培养基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、山梨醇91g/L。菌体复苏培养基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、山梨醇69g/L、甘露醇91g/L。上述培养基均于121℃灭菌20min。1.2pcr和u3000酸SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台:苏州净化设备有限公司;WFJ7200型可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;4380C型电转仪、5804R低温冷冻离心机:德国Eppendorf公司;GNP-9080型隔水式恒温培养箱:上海精宏实验设备有限公司;Veriti96孔热循环梯度聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)仪:美国应用生物系统公司;MD2000核酸超微量分光光度计:美国BioFure公司;ZQYZ-CS型恒温振荡培养箱:上海知楚仪器有限公司;DYY-12电泳仪:北京市六一仪器厂;UVIEssentialV6凝胶成像仪:英国Uvitec公司。1.3实验方法1.3.1引用设计采用Oligo软件设计引物,引物信息见表1。1.3.2b.clausiiql-1菌体基因组的提取同源重组片段spo0A-Cmspo0A基因的调取:挑取B.clausiiQL-1单菌落转接于50mLLB液体培养基,37℃,200r/min培养12h,使用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒对B.clausiiQL-1菌体基因组进行提取。1μL基因组模板、1μLspo0AF和1μLspo0AR引物、12.5μL2×HiFi-PCRmaster、9.5μLddH片段Cm同源重组片段spo0A-Cm1.3.3同源重组片段spo0a-cm采用限制性核酸内切酶BamHⅠ对所得的spo0A-Cm1.3.4b.clausiiql-1单菌落与b.clausiiql-111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111电转缓冲液配制:山梨醇91g/L、甘露醇91g/L、甘油100g/L。将B.ClausiiQL-1单菌落接种于15mL的LB液体培养基中,37℃、200r/min振荡培养12h;将上述菌液以2%接种量转接到50mLLB培养基中,37℃、200r/min振荡培养至OD1.3.5氯霉素的溶解25mg/mL氯霉素的制备:准确称取氯霉素溶解于无水乙醇,溶解后过0.22μm滤膜过滤除菌,分装后于-20℃中保存。感受态与spo0A-Cm1.3.6阳性重组菌株的鉴定以提取到的阳性菌株DNA为模板,spo0AF和Cm1.3.7l-1spo0a菌液接种时间将菌株B.clausiiQL-1与B.clausiiQL-1△spo0A分别以2%接种量接种于LB液体培养基,37℃、200r/min振荡培养28h,将菌液于80℃水浴处理10min。将80℃水浴处理过的出发菌株菌液稀释101.3.8spo0a生长周期测定生长曲线的绘制:挑取菌株B.clausiiQL-1与B.clausiiQL-1△spo0A单菌落于15mLLB液体培养基,37℃、200r/min振荡培养12h,将菌液转接至100mLLB液体培养基至初始OD生物量的测定:每隔12h取样10mL,离心得菌体沉淀,于70℃烘箱烘干至恒质量后测其生物量。1.3.9淀粉酶酶活测定分别将出发菌株B.clausiiQL-1和重组菌株B.clausiiQL-1△spo0A单菌落点涂于可溶性淀粉平板中央,于37℃条件下静置培养36h,观察并比较透明圈大小。分别以2%接种量接种在LB液体培养基中,37℃、200r/min振荡培养,每隔6h取样5mL,4℃、12000r/min离心8min取上清,按照国标GB/T24401—2009《α-淀粉酶制剂》中所示方法测定淀粉酶酶活,并按干质量进行换算为U/g。淀粉酶酶活定义:于60℃、pH值为6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉的酶量,即为一个酶活力单位(U/g)。2结果与分析2.1spo0a片段的pcr扩增以B.clausiiQL-1出发菌基因组为模板,spo0AF和spo0AR为引物进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图2a。由图2a可知,扩增产物大小为500bp左右,与理论长度418bp相符,说明成功获得spo0A片段;以质粒pHT01为模板,Cm通过连续传代15次,以Cm2.2成孢条件的比较通过平板计数法对出发菌株及重组菌株芽孢生成情况进行计算及比较,结果见图4。由图4可知,菌株B.clausiiQL-1芽孢萌发数为3.93×102.3b.clausiiql-1spo0a重组菌生长周期对出发菌株B.clausiiQL-1及重组菌株B.clausiiQL-1△spo0A进行了生长规律分析及生物量测定,结果见图5。由图5a可知,B.clausiiQL-1△spo0A菌株与出发菌株的生长周期基本保持一致,4~18h为对数生长期,18~28h为稳定期,28h后进入衰亡期。由图5b可知,在任何时间段,重组菌株B.clausiiQL-1△spo0A生物量均高于出发菌株B.clausiiQL-1,且均在20h出现最大生物量,分别为3.10mg/mL、2.50mg/mL,生物量提高了24%。2.4最佳水泥砂浆发酵培养菌株的确定可溶性淀粉平板初筛,重组菌株B.clausiiQL-1△spo0A较出发菌株B.clausiiQL-1透明圈增大,重组菌株透明圈与菌落直径比为2.75,出发菌株透明圈与菌落直径比为1.31,说明构建菌株较出发菌株水解淀粉能力更强。进一步于LB液体培养基发酵培养并测定淀粉酶酶活,结果见图6。由图6可知,重组菌株B.clausiiQL-1△spo0A产淀粉能力高于出发菌株B.clausiiQL-1菌株,且发酵至72h时,淀粉酶酶活均达到最高,分别为1.58×103spo0a基因缺失型菌株的构建本实验室通过同源单交换技术成功实现了克劳氏芽孢杆菌spo0A基因的敲除,构建了spo0A基因缺失型菌株B.clausiiQL-1△spo0A,并对其发酵性能进行初步研究,发现spo0A基因缺失型菌株不生成芽孢,且较出发菌株B.clausiiQL-1生物量提高24%,表明spo0A基因不仅是克劳氏芽孢杆菌芽孢形成关键基因,而且也是