mapck信号通路磷酸化在扩张型心肌病患者心肌纤维化中的临床意义

mapck信号通路磷酸化在扩张型心肌病患者心肌纤维化中的临床意义

扩张性心肌病（tcm）是指在心脏无异常压力负荷或冠状动脉（冠状动脉）疾病等心脏疾病的情况下，左心室或双室增大，导致心脏扩张和收缩障碍。这是临床上进展性心力衰竭和起源性猝死的主要原因。1数据和方法1.1供体心脏疾病收集DCM患者接受心脏移植者受体心脏6例（DCM组），并选择移植失败的供体心脏6例作为对照组。DCM的诊断标准参照2006年美国AHA制定的DCM诊断标准，即左心室舒张末期内径>55mm、左心室射血分数（LVEF)<45%或左心室缩短速率<25%1.2学习方法1.2.1左心室肌组织病理学检测收集DCM患者受体心脏及移植失败的供体心脏的左心室肌组织。切取离体心脏的左心室肌组织，生理盐水冲洗后，分为两份。一份立即放入冻存管于液氮中迅速冷冻后-80℃冰箱中保存，用于WesternBlot检测；另一份置于4%多聚甲醛中固定，制作病理石蜡切片，后续染色观察。1.2.2westernblot分析Westernblot法测定两组心室肌组织中MAPKs信号通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的总水平和磷酸化水平、以及下游分子EGR-1的蛋白表达水平。心室肌组织研磨后加入新鲜配制的蛋白裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定各样品的蛋白浓度，将各样品蛋白浓度调整一致，与上样缓冲液混合，加热煮沸10min，使蛋白充分变性，并分装保存在-80℃。蛋白溶解后，行SDS凝胶电泳，再4℃下转膜，PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2h，分别加入抗MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38、EGR-1、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。次日，二抗孵育2h，显影。以GAPDH为内参，测定目标条带及GAPDH的灰度值，两者灰度值比值为目的蛋白的相对表达水平。1.2.3石蜡切片染色4%多聚甲醛固定后的心室肌组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤制成石蜡切片。石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、下行梯度酒精脱苯、水洗、苏木素染色、0.1%盐酸酒精分化、Scott液返蓝、伊红染色、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片；最后，显微镜下观察心肌组织的形态结构及排列特点。1.2.4统计学处理方法制备好的石蜡切片常规脱蜡、脱水后，依次经磷钼酸染色、0.1%苦味酸天狼星红染色、0.01N盐酸分化、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片；最后，光学显微镜下观察心肌组织中红色胶原纤维的分布情况，拍照并计算胶原容积百分比（CVF),CVF=胶原面积/图像面积×100%。1.3统计学处理计量资料数据采用均数±标准差表示。采用SPSS19.0软件，进行数据统计分析。两组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1超声心动图检查DCM患者和对照组年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05）。DCM患者超声心动图检查提示心室扩大，左心室扩张更为显著（69.83±14.71mm），呈离心性扩张；心肌室壁运动幅度普遍减低，左室射血分数明显下降（26.83±8.49%）。2.2心肌细胞排列和谐与对照组相比，HE染色见DCM组心肌组织内心肌细胞不同程度肥大，胞浆内少许空泡形成；心肌细胞排列紊乱，周围间质组织纤维化明显（图1A）。PSR染色可见DCM组心肌组织间质内大量增粗的、亮红色胶原纤维沉积，呈弥漫性分布，CVF较对照组显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（图1B和1C）。以上提示，DCM患者心肌纤维化、心室重构明显。2.3nk1/2、3gp8总蛋白表达水平WesternBlot结果显示，两组间MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的总蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比，DCM组心肌组织内MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的磷酸化水平均明显增高（P<0.05），差异具有统计学意义（图2）。2.4map保乳分子egr-1的蛋白表达水平WesternBlot结果显示，与对照组相比，DCM组心肌组织内MAPKs信号通路下游分子EGR-1的蛋白表达水平明显增高（P<0.05），差异具有统计学意义（图3）。3mapps信号通路目前，DCM临床治疗大多基于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β受体阻滞剂等药物，通过减慢心率、减缓心室重构等改善DCM患者的预后，心脏移植是终末期DCM患者最佳的治疗手段MAPKs信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的信号转导系统的重要成员，通过MAPKK激酶（MAPKKK/MEKK）、MAPK激酶（MAPKK/MEK）和MAPK的级联模式传导细胞外信号，依次磷酸化激活将上游信号传递至下游应答分子，参与调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡、炎症和纤维化修复等生物学过程早期生长反应因子（EGR-1），最早被认为是一种肿瘤抑制因子，在细胞生长、分化和存活中发挥作用，后发现其在免疫应答的启动过程中也发挥重要作用，是生长因子介导纤维化的核心转录因子综上所述，MAPKs信号通路在促进DCM患者心肌纤维化中发挥重要作用，不是通过单一信号途径实现，而是多条信号通路协同促进DCM患者心肌纤维化的进展。动物实验中应用MAPKs信号通路各级