马度米星铵对克氏原螯虾鳃组织结构和抗氧化系统的影响

马度米星铵对克氏原螯虾鳃组织结构和抗氧化系统的影响

刘晓晓、腾培、倪涵、等。马度米星铵对克氏原刺的毒性[j]。动物和兽医，2018，50（5）：46-50。LiuXX,TengP,NiH,etal.Effectofmaduramycinammoniumonthegilltissueofcrayfish[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2018,50(5):46-50.随着畜牧业的高度集约化发展,抗生素在保障畜牧业发展、改善人民生活质量方面发挥着不可替代的作用。然而,随着抗生素越来越广泛的使用,其暴露在环境中的机率也逐渐增大。近年来,抗生素所带来的环境污染和生态毒性引起了国内外极大的关注马度米星铵又称马杜霉素,是从马杜拉放线菌的发酵产物中分离得到的一种新型聚醚类离子载体抗生素。马度米星铵是目前药效最强的聚醚类离子载体抗生素,具有抗球虫谱广、活性高、价格合适和球虫不易产生耐药性等优点,被广泛添加在动物饲料中克氏原螯虾俗称小龙虾,因其肉质鲜美、营养丰富等特征,深受消费者的喜爱,是中国目前重要的经济水产养殖对象本研究以克氏原螯虾为模式动物,在急性毒性试验的基础上进行亚慢性毒性试验,研究不同浓度马度米星铵对克氏原螯虾鳃组织结构和抗氧化酶活性的影响,为评价马度米星铵在环境中的风险提供一定依据。1材料和方法1.1纯度及规格马度米星铵,由浙江汇能生物股份有限公司提供,纯度91.9%以上,批号:1701004。溶剂为95%的乙醇,国药集团化学试剂有限公司生产,批号:20130207。1.2试验养殖过程试验所用克氏原螯虾由江苏省淡水研究所提供,体重(23.03±2.12)g,置于含有适量水的聚乙烯塑料箱内(60cm×40cm×30cm),驯养1周后用于试验。每天投喂颗粒饲料2次,按照体重的1%足量投喂。2d换水1次,不间断供氧。养殖用水为经3d曝气、pH为7.0~7.4的脱氯自来水。养殖期间水温(20±2)℃,水中溶氧6.0mg·L1.3试验设计急性毒性试验参照魏华等根据急性毒性试验结果,设定低、中、高3个剂量组(0.7、3.5和7.0mg·L1.4组织匀浆蛋白测定鳃组织样品在4℃下解冻,用剪刀剪碎,称重,放入匀浆管中,以1∶9的重量体积比(W/V),加入预冷的0.86%生理盐水,匀浆机匀浆,4℃下2500r/min离心10min后立即取上清液。鳃组织匀浆液蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法,考马斯亮蓝蛋白试剂盒购自南京建成生物工程研究所。鳃组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量(以每毫克蛋白计)的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒,按照说明书操作步骤进行。1.5渔船组织疾病的切开术常规石蜡切片,固定液固定、常规梯度酒精脱水、石蜡包埋,制成5~6μm切片,HE染色,显微镜下观察。1.6数据分析采用改良寇氏(Karber)法2结果与分析2.1马度米星铵对克氏原螯虾幼虾感染的影响试验期间,空白对照组与溶剂对照组克氏原螯虾活力良好,均未发生死亡。剂量组克氏原螯虾在接触试液初期出现暂时性兴奋,表现为异常活跃,快速游动。随后2个高剂量组克氏原螯虾口吐白色黏性分泌物,出现死亡。随着中毒时间的延长,克氏原螯虾出现仰头呼吸、活力下降、侧游、行动迟缓和翻转后无力翻身等中毒症状。如表1所示,随马度米星铵浓度的增加,克氏原螯虾死亡率越大;相同浓度条件下,染毒时间越长,克氏原螯虾死亡率越高。以改良Karber方程对试验结果进行统计分析,得出96h的LC2.2马度米星铵对克氏原螯虾各组织中cat活力的影响克氏原螯虾暴露在含不同浓度马度米星铵水体中,鳃组织SOD活性变化如图1所示,与空白对照组相比,7d时呈剂量依赖性,随马度米星铵浓度的增加,SOD活性逐渐下降。低剂量组SOD活力呈时间依赖性,随时间延长而逐渐降低,28d时酶活力极显著低于空白对照组(P<0.01);中剂量组14d时SOD活力极显著降低(P<0.01),28d时活力回升,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05);马度米星铵暴露7d后,高剂量组SOD活性呈现极显著降低(P<0.01),28d时恢复至略低于空白对照组(P>0.05)。结果表明,整个暴露过程中,低剂量组鳃组织SOD活性逐渐被抑制,中、高剂量组SOD活性随时间延长先下降后上升。暴露在不同剂量马度米星铵中克氏原螯虾鳃组织CAT活性变化如图2所示,与空白对照组相比,呈现先升高后降低的趋势。暴露7d时各剂量组与空白对照组相比酶活力升高,14d时各剂量组与空白对照组相比表现为抑制,但差异均不显著(P>0.05)。暴露28d时,剂量组表现为明显抑制,与空白对照组相比,低、中剂量组酶活力极显著降低(P<0.01),高剂量组显著降低(P<0.05)。结果表明,经马度米星铵暴露7d后,各剂量组CAT活力虽然有一定的变化(轻微诱导),但是与对照组相比差异不显著;暴露28d后CAT活力表现下降,显著低于对照组的CAT水平,说明在28d后克氏原螯虾CAT活力受到抑制。不同浓度马度米星铵对克氏原螯虾鳃组织MDA含量变化如图3所示,与空白对照组相比,中、高剂量组暴露7d时MDA含量上升,但差异均不显著(P>0.05),之后随时间的延长逐渐被抑制。28d时,与空白对照组相比,中剂量组MDA含量显著下降(P<0.05),高剂量组极显著下降(P<0.01)。而28d内低剂量组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明,整个马度米星铵暴露过程中,低剂量组对克氏原螯虾鳃组织氧化作用与空白对照组比差异不显著;中、高剂量组在7d时对克氏原螯虾鳃组织产生轻微氧化作用,但在较长时间(28d)作用下则减轻了机体的脂质过氧化作用。2.3管腔微血管腔结构由图4A可见,空白对照组鳃叶结构完整,鳃膜平整光滑,有规则。内部呼吸上皮细胞整齐有序的排列在微血管腔外,微血管腔内有血细胞。与空白对照组相比,低剂量组(图4B)少量呼吸上皮细胞从鳃膜上脱落进入微血腔,细胞核浓缩或成碎片化,微血管腔结构不完整;中剂量组(图4C)大部分呼吸上皮细胞脱落溶解,微血管腔结构几乎完全消失,局部鳃膜结构模糊;高剂量组(图4D)呼吸上皮细胞几乎完全坏死并从鳃膜上脱落,鳃膜结构受损,不光滑,看不到正常的鳃结构。3讨论3.1马度米星铵对克氏原虾的快速毒性作用根据鱼类急性毒性分级标准,本试验得到的马度米星铵对克氏原螯虾96hLC3.2重度环境胁迫对生物sod活性的影响在正常生理情况下,机体中的活性氧与抗氧化系统处于一种动态平衡的状态。只有受到胁迫时,机体产生大量活性氧自由基,超出抗氧化系统的清除能力,对机体造成氧化损伤。SOD和CAT是机体抗氧化体统中的关键酶,能够减轻O研究表明,当生物体受到轻度逆境胁迫时,SOD活性往往升高;而当受到重度环境胁迫时,SOD活性通常降低,使生物体内积累过量的活性氧,从而导致生物体的损伤。本试验结果显示鳃组织SOD活性随药物剂量的增加而逐渐被抑制,表明马度米星铵的暴露浓度已经超出克氏原螯虾机体所能承受的范围,造成了机体的氧化损伤,与王瑞龙等本试验MDA含量低剂量组与空白对照组相比没有显著差异,中、高剂量组7d时MDA含量有所上升后逐渐下降,暴露28d后MDA含量显著低于空白对照组。表明暴露7d时鳃组织可能处于脂质过氧化状态,随暴露时间的延长(14d),逐渐被机体抗氧化系统清除,减轻了机体的脂质过氧化作用。此外根据研究表明3.3低剂量依赖试验本研究结果显示,胁迫28d后,鳃组织损伤程度呈现药物剂量依赖性,即药物浓度越高,损伤越严重。低剂量组便能观察到明显的病理变化;中剂量组可见微血管腔结构已经完全消失,大部分呼吸上皮细胞脱落、坏死;高剂量组呼吸上皮细胞几乎完全脱