响应面法优化l-赖氨酸高产菌发酵培养基

响应面法优化l-赖氨酸高产菌发酵培养基

-氨基丙烯酸或2-氨基丙烯酸的英典名称为c。L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的8种必需氨基酸中最重要的一种。赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产品11.1材料表面1.1.1病毒作者实验保藏菌株黄色短杆菌(1.1.2产品的类型L-赖氨酸、L-缬氨酸等为上海生化技术公司产品;NTG、SG均为美国Sigma公司产品;DES为国药集团化学试剂有限公司产品;茚三酮为上海试剂三厂产品。1.1.3培养基(1)基本培养基g.l葡萄糖20、(NH(2)完全培养基g.l葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨10、NaCl5、琼脂20。(3)种子培养部位g.l葡萄糖25、玉米浆25～30、(NH(4)调ph及灭菌葡萄糖150、玉米浆15、(NH基本、完全和种子培养基均用质量分数20%NaOH调pH至7.0～7.2,121℃灭菌20min。发酵培养基用20%NaOH调pH至7.0～7.2,115℃灭菌8min。1.2方法1.2.1培训方法1.2.1.1.倾斜和平面培养方法恒温箱温度30±1℃,培养24h。1.2.1.种子培养和管理摇床为往复摇床,振次100±2次/min,温度30±1℃,种子装液量250mL三角瓶30mL,种子培养12h;发酵装液量500mL三角瓶25mL,发酵培养72h。1.2.2强制改变方法常规化学诱变法1.2.3过滤方法1.2.3.菌落生长的方式缬氨酸缺陷型的获得:把诱变的菌液涂在基本培养基上,31℃培养2～4d标出生长的菌落,再倒上一层含缬氨酸的基本培养基,再次生长出来的菌落可能为缬氨酸缺陷型,挑出后长出来的菌落,如果在基本培养基上不生长,而在含有缬氨酸的基本培养基上能生长的为缬氨酸缺陷型。磺胺胍(SG)抗性的获得:把诱变的菌液涂布在含有SG的基本培养基上,培养3～4d,挑出生长的菌落,即为SG1.2.3.2.摇瓶筛选将平板筛选获得的变异株接一环于装有25mL发酵培养基的500mL三角瓶中,振荡培养72h,测定发酵液中的L-赖氨酸。1.2.4样本抗氧化测定pH值:用精密pH试纸和酸度计测定。菌体生长:吸取样品菌液0.2mL到0.25mol/LHCl5mL溶液中,摇匀后测定OD还原糖:菲林试剂滴定法L-赖氨酸:纸上层析法和酸性茚三酮法22.1高丝氨酸脱氢酶催化合成氨基酸由图1可知,由葡萄糖生产赖氨酸的代谢途径包括EMP途径、TCA循环、乙醛酸循环、二氧化碳固定反应、草酰乙酸氨基化反应生成天冬氨酸、天冬氨酸在天冬氨酸激酶和天冬氨酸-β-半醛脱氢酶催化下生成环天冬氨酸-β-半醛,然后分成两路,一方面在DDP合成酶等一系列酶催化下生成赖氨酸,另一方面在高丝氨酸脱氢酶催化下生成高丝氨酸,又分为两路:一路在琥珀酰高丝氨酸合成酶等一系列酶催化下生成蛋氨酸,另一方面在高丝氨酸激酶等酶催化下生成苏氨酸,苏氨酸又在苏氨酸脱氢酶等催化下生成异亮氨酸。增加前体物质的合成、减弱或切断支路代谢和促进产物的分泌是提高赖氨酸产量的思路。丙酮酸是合成天冬氨酸的前提物质,在胞内丙酮酸能生成缬氨酸,使用氨基酸分析仪测得缬氨酸占总氨基酸的10%,所以定向选育缬氨酸缺陷型,能很大程度上增加丙酮酸的量,从而增加了赖氨酸合成的前提物质;同样在胞内丙酮酸能生成乙酸和乙醇,因此添加乙酸和乙醇能会促进丙酮酸含量的增加从而增加赖氨酸的积累;在发酵过程中添加吐温-80和二甲基亚砜来改变细胞表面结构,使细胞转向分泌型,以增加赖氨酸的积累;天冬氨酸合成过量,会反馈抑制PEP羧化酶的活性,因此选育天冬氨酸结构类似物抗性突变株能防止PEP羧化酶活性的减弱,从而提高糖质生产赖氨酸的转化率。2.2高羊茅的选择2.2.1高羊茅的选择黄色短杆菌XQ-8经DES诱变、NTG诱变,依次被赋予磺胺胍抗性、缬氨酸缺陷型(SG2.2.2产l-赖氨酸稳定性将目的突变株XQ-89在斜面上连续接种5代,摇瓶发酵考察其产L-赖氨酸的稳定性,结果见表1。从表1结果可知,目的菌株XQ-89通过连续传代5次,菌株的遗传标记和产酸率稳定,表明其遗传性状稳定,可用于进一步研究。2.3增加乙酰coa的量,增加天冬氨酸的合成天冬氨酸与乙酰CoA形成平衡合成,增强乙酰CoA的量,加强天冬氨酸的合成,在发酵培养基中添加乙酸、乙醇,可使乙酰CoA的量增加,强化天冬氨酸的合成。在培养基中加入不同浓度的乙醇和醋酸,发酵72h测定赖氨酸,得到它们对赖氨酸发酵的影响如图3。由图3可知,乙酸的添加量为0.6%赖氨酸的产量达到最高值,乙醇的添加量为0.4%时赖氨酸的产量达到最高值,而且可以看出乙酸的作用效果比乙醇好。2.4基亚和吐温-80二甲基亚砜和吐温-80根据发酵过程变化曲线,在发酵16h时赖氨酸从细胞分泌出速率陡增。所以确定从发酵16h开始每隔4h加二甲基亚砜或吐温-80,以确定最佳的添加时间和浓度。在发酵不同时间加入不同浓度的二甲基亚砜和吐温-80,发酵72h测定赖氨酸,得到它们对赖氨酸发酵的影响。吐温-80、二甲基亚砜对赖氨酸发酵的影响见表2。由表2可知,在发酵20h加入1.5%(体积比)二甲基亚砜或0.3%(质量比)吐温-80,赖氨酸产量提高了9.4%和10.23%,且吐温-80的作用好于二甲基亚砜。2.5玉米浆添加量对赖氨酸产量的影响实验中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的玉米浆,于30℃、100r/min下发酵72h,测定赖氨酸的产量,由图4可知玉米浆对赖氨酸产量的积累产量影响显著,最佳添加浓度为1.5%,赖氨酸产量为85.6g/L。玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源,含有各种氨基酸、生长因子等,成分较复杂,用量过少对菌体生长及产酸不利;用量过多,菌体生长受到抑制,产酸下降,而杂酸量上升,对后续提取不利。2.6回归模型的建立及显著性检测由于乙酸、吐温-80、玉米浆的添加量对赖氨酸的生物合成有明显的影响,在此基础上,采用三因素三水平的响应面分析方法,以赖氨酸产量为响应值,实验设计见表3,结果表略。根据实验结果,以赖氨酸的产量Y为响应值,确定回归方程的系数,得到如下的二次回归方程:Y=88.28+4.5X经方差分析,可以看出:二次项和交互项对结果影响显著(由回归方程,应用Matlab7.1软件进行分析作响应曲面图,见图5～图7。由图5～图7可知,在实验因素水平设定的范围内,玉米浆浓度为1.0～1.5%范围内对赖氨酸产量有显著影响,玉米浆浓度大于1.5%反而会迅速降低赖氨酸的产量;吐温-80浓度最适在0.2～0.4%,过量会对菌体的生长起抑制作用;乙酸添加对产赖氨酸影响不是很显著,其最适浓度为0.5～0.7%;此时发酵液赖氨酸含量可达94g/L。由图中可以看出,回归模型存在稳定点,稳定点即最大值,利用回归方程分别对X3菌株的筛选和遗传标记的制备MattheosKof