带状疱疹疫苗生产中2型糖尿病细胞培养工艺的建立

带状疱疹疫苗生产中2型糖尿病细胞培养工艺的建立

随着国家对原料的要求越来越高，生产工艺的要求也越来越高。培养瓶生产工艺的缺点是每个培养瓶均是一个独立的细胞培养单元,细胞质量会影响病毒产量,导致每瓶疫苗的滴度不同,疫苗批间产生差异,且占用空间、劳动强度也很大,对疫苗产量的扩大及质量的提高均形成了严重的制约。为使疫苗的产量和质量达到更高标准,企业应采用可控性强、操作便利、节约生产成本和空间的生产工艺制备疫苗。本实验旨在建立带状疱疹疫苗生产中2BS细胞细胞工厂培养工艺1材料和方法1.1细胞和病毒人二倍体细胞2BS株由北京天坛生物制品有限公司提供;水痘-带状疱疹病毒为长春祈健生物制品有限公司保存。1.2球酶、胰酶和细胞工厂MEM培养基购自美国海克隆实验室有限公司;胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司;新生牛血清购自太原润生生物科技有限公司;胰酶购自美国BectonDickinsonandCompany;细胞工厂购自丹麦NUNC公司;细胞计数仪(型号:IC1000)购自中国countstar;冰点渗透压仪(型号:3250)购自美国AdvancedInstruments。1.3细胞培养的mem液细胞复苏培养液:含20%胎牛血清的MEM液,细胞传代培养液:含10%新生牛血清的MEM液,培养的pH值均为7.2~7.5,渗透压均为250~300mOsmol/kg。1.4细胞恢复和基本扩张从液氮罐中取出2支2BS细胞,常规复苏(28代),待细胞长成致密单层后,用0.25%胰蛋白酶消化传代1.6网状减毒活疫苗的制备及加标试验将每个参数剩余的1个细胞工厂按MOI0.008接种水痘-带状疱疹病毒,显微镜下观察细胞病变情况。按疫苗生产工艺步骤经洗涤、收获、滤过、合并冻干等工序,制备成带状疱疹减毒活疫苗。按照带状疱疹减毒活疫苗制造及检定规程标准检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验:将疫苗成品系列稀释后,至少取2个稀释度的病毒液接种2BS细胞,再加入病毒培养液,置(37±0.5)℃,5%CO1.7统计分析应用EXCEL软件进行统计学分析,数据的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细胞工厂和克氏原螯虾生长特性显微镜下观察可见,35代细胞按1∶4分种至细胞工厂,细胞较暗、较细,走势较乱,基本能长成薄单层,但有空隙;36代细胞按1∶2分种至细胞工厂,细胞较亮、较粗壮,走势较整齐,能长成单层,长势明显好于传代比例为1∶4的细胞。在细胞工厂传代比例为1∶2,培养液加量为300ml/层时,细胞生长的各个阶段均正常;培养液加量为200ml/层时,细胞长势缓慢,生长不旺盛,形态不佳;培养液加量为400ml/层时,细胞长势不旺盛,分裂相不足。见图1。克氏瓶传代比例为1:2或1:4,培养液加量为200ml/瓶,细胞生长的各个阶段均正常。见图2。2.2异无统计学意义克氏瓶细胞传代比例为1∶2、1∶4时,细胞数量差异无统计学意义(P>0.05),见表1。在细胞工厂中,细胞传代比例为1∶2,培养液加量为300ml/层时,细胞数为(7.6~7.7)×102.3适当降低感染时细胞形态显微镜下观察可见,传代比例为1∶2,培养液加量为300ml/层,细胞工厂收获时细胞病变达80%以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4,培养液加量为300ml/层,细胞工厂收获时细胞病变约为60%,病变细胞形态较差,圆润度不好,不广泛,细胞局部有撕裂现象。见图3。2.4疫苗的质量标准检测结果显示,传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃稳定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6lgPFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求。见表4。3细胞质量与细胞增长的关系显微镜下观察显示,36代细胞1∶2传至37代,细胞能长成单层,长势明显好于35代细胞1∶4传至37代,1∶4传代的细胞基本能长成薄单层,但有空隙。克氏瓶1∶2与1∶4比例传代的细胞无明显差异,但在细胞工厂中则截然不同,细胞传代比例为1∶2,培养液加量为300ml/层时,细胞各生长阶段均正常;培养液加量为200ml/层,细胞长势缓慢,生长不旺盛,形态不佳,原因是营养成分不足所致;培养液加量为400ml/层,细胞数较少,长势不旺盛,分裂相亦不足,原因是氧气不足所致。细胞传代比例为1∶4时,由于传代比例过低,营养成分、氧气不足,导致两种传代比例的细胞数相差约1000万。在相同加液量下,两种传代比例的细胞数差异有统计学意义(P<0.001)。细胞病变的圆润、典型、广泛程度直接决定疫苗的质量和产量。在相同条件下,细胞质量越好,数量越多,在其体内繁殖的病毒质量就越好,生产的疫苗质量也越好,产量越高。本实验结果表明,1∶4传代的细胞病毒滴度明显低于1∶2传代的细胞。细胞工厂的使用,可全面实现细胞培养的自动化,大大降低劳动强度和密集度,提高生产率,降低污染率,而且细胞工厂的操作性、可控性更强,只要掌握好传代比例,控制好营养成分,保证供氧充足,细胞工厂可替代传统的培养瓶培养技术,实现大规模的细胞培养,制备出质量均一的细胞。1.5细胞传代培养分别将上述转瓶培养的35、36代细胞制成细胞悬液,35代细胞悬液按1∶4分种至6个10层细胞工厂中,36代细胞悬液按1∶2分种至6个10层细胞工厂中,培养液加量分别为200、300、400ml/层,每种分装量均为2个,传代后细胞代次均为37代,置(37±5)℃培养3~4d。同时用克氏瓶培养两种传代比例的细胞作为对照,200ml/瓶,置(37±0.5)℃静止培养3~4d。细胞工厂和