遗传变异专业知识专家讲座

第二节基因突变及菌种选育

1遗传变异专业知识专家讲座第1页一、基因、基因符号以及相关术语1、基因是合成一条多肽或RNA所必需完整核酸序列。2、基因组、基因型是指生物单倍体细胞全部基因。基因组侧重“全部碱基对序列组成”；基因型（genotype）是生物基因表达功效、特征，侧重“某个基因”。2遗传变异专业知识专家讲座第2页3、基因符号常以说明某个基因功效特征英文前3个字母表示，普通用小写斜体，该基因功效特征在右上角以＋/－、r/s表示。组氨酸基因用his（histidine前3个字母）表示，his-表示组氨酸缺点型；

gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖（galactose）和不能发酵半乳糖；

strs、strr分别表示对链霉素（streptomucin）敏感和具抗性。

基因座位(genelocus)指各个基因在染色体上特定位置。3遗传变异专业知识专家讲座第3页4、性状是组成一个生物个体相关结构、形态、物质和功效等各方面特征总称。5、表型指微生物在特定条件下表现出来某种生物学特征。4遗传变异专业知识专家讲座第4页

二、基因突变（一）基因突变术语突变（mutation）

DNA或RNA中核苷酸序列发生了稳定可遗传改变，造成微生物性状发生改变。基因突变（点突变）

DNA链上一对或少数几对碱基发生改变。染色体畸变

DNA大片段改变（插入，缺失，重复，易位、倒位等）

5遗传变异专业知识专家讲座第5页野生型菌株与突变型菌株

野生型菌株，从自然界分离到任何微生物在其发生突变前原始菌株。

突变型菌株，野生型菌株经突变后，性状改变菌株。正向突变与回复突变正向突变突变型菌株

回复突变

回复突变，野生型菌株经突变成为突变型菌株以后，经再一次突变，有时突变型菌株又恢复为野生型菌株原有性状，则这次突变被称为回复突变。

野生型菌株（或野生型菌株表型）

6遗传变异专业知识专家讲座第6页

自发突变与诱发突变自发突变，自然条件下发生突变。诱发突变，用各种人工原因处理细胞，突变率大大增加，这种突变称为诱变。诱变剂，如紫外线、亚硝酸等。突变率，在生长微生物群体中，每一细胞某一性状在每一世代中独立发生突变机率。普通也可简单地用每单位群体在繁殖一代过程中所形成突变细胞平均数来表示。7遗传变异专业知识专家讲座第7页1、形态突变（1）细胞形态—鞭毛，芽孢，荚膜有没有，L型细菌。（2）菌落形态—大小，光滑和粗糙，颜色等，孢子颜色。普通为非遗传型表型变异，肺炎球菌失去荚膜：S→R

变形杆菌：2%琼脂，长鞭毛，薄膜状菌落；6%琼脂或0.1%碳酸形成单个生长菌落。（二）突变类型（依据突变体表型来分）8遗传变异专业知识专家讲座第8页2、致死突变（1）基因突变造成个体死亡（2）条件致死型

e.g.温度敏感突变型—E.coli37℃生长，42℃下不生长，主要是突变引发了一些主要蛋白质结构和功效改变。9遗传变异专业知识专家讲座第9页

3、抗性突变型（1）抗药性（耐药性），可作为选择性标识。（2）抗噬菌体。4、抗原突变型抗原成份（eg.cellwall，鞭毛，荚膜，病毒表面蛋白等）变异。5、产量突变型经过基因突变而产生在代谢产物产量上显著有别于原始菌株突变株。如产量显著高于原始菌株者为正变株，反之为负变株。10遗传变异专业知识专家讲座第10页6、营养缺点型（auxotroph）因为基因突变，而丧失合成一个或几个生长因子能力，必须在培养基中添加对应营养成份才能正常生长繁殖突变型。（e.g.AA,vitamin）野生型（wildtype）：从自然界分离到任何微生物在其发生营养缺点型突变前原始菌株。原养型(prototroph)：普通指营养缺点型突变株经回变或重组后产生菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。

11遗传变异专业知识专家讲座第11页

基本培养基（MM）——能够满足野生型菌株生长最低程度需要培养基。

补充培养基（SM）——凡能满足对应营养缺点型生长需要培养基。在MM中加蛋白胨（各种氨基酸)便能够用来培养各种氨基酸缺点型；加入酵母浸膏(其中含有各种B族维生素和核苷酸)便能够培养不一样维生素、嘌呤和嘧啶缺点型。完全培养基（CM）——凡能满足一切营养缺点型生长需要培养基。12遗传变异专业知识专家讲座第12页

13遗传变异专业知识专家讲座第13页生物化学统一性法则：人和细菌在DNA结构及特征方面是一致，能使微生物发生突变诱变剂必定也会作用于人DNA，使其发生突变，最终造成癌变或其它不良后果。化学药剂对细菌诱变率与其对动物致癌性成正比。超出95％致癌物质对微生物有诱变作用，90％以上非致癌物质对微生物没有诱变作用。诱变剂共性标准：（四）突变株应用——Ames试验（遗传毒性试验之一）14遗传变异专业知识专家讲座第14页美国加利福尼亚大学BruceAmes教授于1975年创造，所以称为Ames试验。原理：检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphmurium）组氨酸营养缺点型菌株（his-）回复突变率。15遗传变异专业知识专家讲座第15页

16遗传变异专业知识专家讲座第16页证实Ames试验主要性应用实例：

上世纪60-70年代，一个降低妇女妊娠反应药品“反应停”流行。但随即发觉畸形儿出生率显著增高(海豹肢症)，而且生产畸形儿妇女大多曾服用“反应停”。采取Ames试验发觉这种物质确实含有很强致突变作用，所以这种药品被禁止使用。药品开发过程中，必须有“三致”试验数据，才能够取得同意。当前，在临床医生严格指导下，我国众多皮肤科、免疫科和肿瘤科患者正在接收着“沙利度胺”——“反应停”治疗。17遗传变异专业知识专家讲座第17页

调查显示，孕妇怀孕时末次月经后第34到50天是反应停作用敏感期，在此时间段以外服用反应停，普通不会造成胎儿出生缺点。

/biology/biomed/400225.shtml18遗传变异专业知识专家讲座第18页（二）基因突变主要规律1、自发性和不对应性2、稀有性：环境原因影响，DNA复制过程偶然错误等而造成，普通频率较低，通常为10-6~10-9

。3、诱发性：一些物理、化学原因对生物体DNA进行直接作用，突变以较高频率产生。（诱变剂仅起着提升诱变率作用）4、独立性：某个基因突变是一独立事件，对其它基因突变几率没有影响。5、稳定性6、可逆性19遗传变异专业知识专家讲座第19页变量试验（fluctuationanalysis）SalvadorLuria&MaxDelbrück（1943）20遗传变异专业知识专家讲座第20页影印平板法惯用于营养缺点型判别、分离。21遗传变异专业知识专家讲座第21页

22遗传变异专业知识专家讲座第22页若干细菌某一性状自发突变率菌名 突变性状 突变率E.coli 抗T1噬菌体 3×10–8E.coli 抗T3噬菌体 1×10–7

E.coli 不发酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外线 1×10–5Staphylococcusaureus抗青霉素 1×10–7S.aureus 抗链霉素 1×10–9

Salmonellatyphi 抗25g/L链霉素1×10–6

Bacillusmegaterium抗异烟肼 5×10–523遗传变异专业知识专家讲座第23页三、基因突变分子机制（一）自发突变分子机制1、低剂量诱变原因长久综合效应外源性诱变原因：各种辐射、环境中低浓度诱变剂、高温、宇宙射线等(量效关系)

内源性诱变原因：各种代谢物（如H2O2、咖啡碱、硫氰化合物）、转座因子2、碱基结构改变A＝T；G＝C。据统计，碱基对发生自发突变几率约为10-8～10-9。T（酮式）变为T（烯醇式），则T＝G。

5-MeC自发脱氨作用。24遗传变异专业知识专家讲座第24页酮式—烯醇式互变异构

胺式—亚胺式互变异构

25遗传变异专业知识专家讲座第25页26遗传变异专业知识专家讲座第26页27遗传变异专业知识专家讲座第27页3、环出效应DNA102345678911023456789110‘2‘8‘9‘1‘10‘2‘3‘4‘5‘6‘7‘8‘9‘1‘序列3和序列7配对成环28遗传变异专业知识专家讲座第28页29遗传变异专业知识专家讲座第29页

碱基结构改变30遗传变异专业知识专家讲座第30页（二）诱发变异机制1、化学诱变剂引发突变（1）碱基对直接置换（即一对碱基被另一对碱基所置换,分为转换和颠换。）

如：惯用亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。亚硝酸诱变机制,使碱基发生氧化脱氨，腺嘌呤A变成次黄嘌呤H，胞嘧啶C变成尿嘧啶U。能引发颠换诱变剂极少，只是部分烷化剂才有。31遗传变异专业知识专家讲座第31页

32遗传变异专业知识专家讲座第32页

①腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He），He经过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）。②DNA双链第一次复制，结果Hk在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基胞嘧啶C配对。③DNA双链第二次复制，其中胞嘧啶（C）正常与鸟嘌呤（G）配对，使A-T→G-C，从而实现转换。④当胞嘧啶被氧化成尿嘧啶（U）时，也可实现G-C→A-T。33遗传变异专业知识专家讲座第33页ATGC34遗传变异专业知识专家讲座第34页GCAT35遗传变异专业知识专家讲座第35页

碱基置换在编码蛋白基因中可能作用：DNA单一密码子改变产生不一样蛋白。36遗传变异专业知识专家讲座第36页（2）碱基类似物引发间接置换（5-BU，5-AU，

8-NG）

5-BU是T结构类似物，普通以酮式状态存在，可与A配对；有时以烯醇式状态存在，当DNA进行复制时，就只能与G配对。

G再正常与C配对，完成A-T转换成G-C。

37遗传变异专业知识专家讲座第37页38遗传变异专业知识专家讲座第38页硝酸与5-BU诱变机制异同亚硝酸5-BU直接作用于原有碱基，改变其结构掺入DNA代谢，替换正常碱基对繁殖细胞、休止细胞都有作用仅对繁殖细胞有作用子二代出现转换子三代出现转换可发生回复突变可发生回复突变39遗传变异专业知识专家讲座第39页（3）移码突变（frame-shiftmutation）

一个诱变剂引发DNA分子中一个或几个核苷酸增加或缺失，从而造成突变点以后全部遗传密码转录和翻译都发生错误。例，原黄素、吖啶黄等吖啶类染料均可引发移码突变，增加一个碱基距离，3.4Å。40遗传变异专业知识专家讲座第40页41遗传变异专业知识专家讲座第41页（4）染色体畸变

一些理化因子，引发DNA大损伤。包含染色体结构上缺失、重复、插入、易位和倒位，也包含染色体数目标改变。

①缺失是指染色体丢掉了某一区段。因而会失去一些基因，并直接影响到基因排列次序、基因间相互关系。②重复是指染色体上个别区段增加。③倒位是指正常染色体某区段断裂后，断裂片段倒转180度又重新连接愈合。④易位是染色体上一区段断裂后再顺向或逆向地插入到同一条染色体其它部位上。对于染色体间畸变，则指非同源染色体间易位。42遗传变异专业知识专家讲座第42页

诱变原因 在DNA上初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟胺 与胞嘧啶起反应 GC→AT转换亚硝酸 A、G、C氧化脱氨作用 AT=GC双向转换 交联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 AT→TA颠换 丧失烷化嘌呤 GC→CG颠换 糖-磷酸骨架断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丫啶类 碱基之间相互作用（双链变形） 码组移动（＋或－） 紫外线 形成嘧啶水合物 GC→AT转换 形成嘧啶二聚体 码组移动（＋或－） 交联 电离辐射 碱基羟基化核降解 AT=GC双向转换

DNA降解 码组移动（＋或－） 糖-磷酸骨架断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丧失嘌呤

加热 C脱氨基 CG→TA转换

Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动 若干诱变剂作用机制及诱变功效（往往不止单种功效）43遗传变异专业知识专家讲座第43页四、突变修复*以紫外线照射形成胸腺嘧啶二聚体修复为例44遗传变异专业知识专家讲座第44页1.

光复活经紫外线照射后微生物马上暴露于可见光下时，可显著降低其死亡率现象，称为光复活作用。光复活酶，又称光裂解酶45遗传变异专业知识专家讲座第45页2.

暗修复主要指切除修复。是细胞内主要修复系统。

46遗传变异专业知识专家讲座第46页3、重组修复这是在DNA复制时进行一个越过损伤修复。47遗传变异专业知识专家讲座第47页普通认为，SOS修复系统是紫外线诱发突变主要原因。

4、SOS修复指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导一个DNA修复方式。修复结果只是能维持基因组完整性,提升细胞生成率,但留下错误较多,使细胞有较高突变率。

48遗传变异专业知识专家讲座第48页三、菌种选育（一）自发突变与育种

从生产中选育、定向培养优良菌种

（卡介苗(BCG)是法国科学家Calmette和C．Guerin经历了l3年时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了230代，才在1923年成功地取得。）

特点：自发突变频率很低，培育新种过程十分迟缓49遗传变异专业知识专家讲座第49页（二）诱变育种

1．挑选优良出发菌株，

2．选择简便有效诱变剂，

3．处理单孢子（细胞）菌悬液，

4．选取最适剂量，

5．充分利用复合处理协同效应，

6．设计或采取高效筛选方案或方法50遗传变异专业知识专家讲座第50页

51遗传变异专业知识专家讲座第51页（三）杂交育种（细胞水平）（四）基因工程52遗传变异专业知识专家讲座第52页第三节

基因转移和重组基因重组（generecombinant）两个不一样个体内遗传基因转移到一起，经过遗传分子间重新组合，形成新遗传型个体方法。原核微生物基因重组转化（transformation）游离DNA分子+感受态细胞接合（conjugation）细胞与细胞直接接触转导（transduction）由噬菌体介导原生质体融合（protoplastfusion）53遗传变异专业知识专家讲座第53页肺炎链球菌转化试验1928年，Griffith首先发觉转化现象。54遗传变异专业知识专家讲座第54页一、转化（transformation）

受体菌（recipient）接收供体菌（donor）裸露DNA片段，从而取得供体菌部分遗传性状现象。55遗传变异专业知识专家讲座第55页

范围：转化现象最早发觉于肺炎链球菌，当前了解，许多革兰氏阳性菌和阴性菌均能进行转化，如嗜血杆菌、芽胞杆菌等。大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌及链霉菌等需经人工处理后才能进行转化。56遗传变异专业知识专家讲座第56页1、转化条件（1）供体DNA片段大小，MW为106-108，同源（普通30%以上即认为同源性较高）、未变性。（2）受体菌生理状态感受态—受体菌能吸收外源裸露DNA片段暂时性生理状态与菌特异性、生理状态、菌龄及培养条件等相关；Ca2+、Mg2+；冷热激处理57遗传变异专业知识专家讲座第57页2、转化过程——肺炎链球菌为例（1）吸附—双链DNA与感受态细胞表面受体结合（数分钟）。（2）吸收—转化DNA双链经核酸酶作用，其中一条链降解，另一条链进入细胞。低浓度溶菌酶可提升细胞壁通透性，从而提升转化率。（3）重组—供体菌单链DNA片段→受体菌染色体组同源区段配对→受体菌原对应单链被切除→整合、取代、连链（DNA连接酶）→杂合DNA区段→复制→重组子（4）DNA复制与细胞分裂→供体菌部分遗传性状延续。58遗传变异专业知识专家讲座第58页

同源区段配对复制与分离

59遗传变异专业知识专家讲座第59页3、转化类型（1）自然遗传转化自然感受态出现是细胞一定生长阶段生理特性，受细菌本身基因控制。是自然界基因交换主要方式。（2）人工转化人工感受态则是经过人为诱导方法，使细胞具有摄取DNA能力，或人为地将DNA导入细胞内。（3）原生质体转化60遗传变异专业知识专家讲座第60页

特殊转化——转染（transfection）提取噬菌体或病毒DNA/RNA来转化感受态受体菌，并产生正常子代病毒或噬菌体。(区分于真核生物转染)61遗传变异专业知识专家讲座第61页二、接合（conjugation）

经过供体菌与受体菌细胞之间直接接触，遗传物质自供体菌转移入受体菌（原核微生物遗传物质转移方式，较广泛）。范围：革兰氏阴性菌中几乎全部肠道菌科细菌，革兰氏阳性菌中链球菌、枯草杆菌、葡萄球菌、厌氧菌以及链霉菌等。

62遗传变异专业知识专家讲座第62页“U”型管试验（BernardDavis，1950）证实接合过程需要细胞间直接接触U形管中间滤板，允许培养基营养物质经过，但细菌无法经过。63遗传变异专业知识专家讲座第63页

F因子（F质粒/致育因子）1、性状—含F质粒菌株，有1-4根性菌毛；2、特点—F因子可游离于细胞内，也可插入或整合到染色体上（附加体）；3、F因子分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行20多个基因。64遗传变异专业知识专家讲座第64页65遗传变异专业知识专家讲座第65页4、F因子四种细胞形式依据细胞中是否存在F因子以及其存在方式不同，把E.coli分成四种菌株。①F－菌株：不含F因子，没有性菌毛，但能够经过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；②F＋菌株：F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。③Hfr（高频重组）菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。④F’菌株：Hfr菌株内F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离但携带一小段染色体基因F因子，称为F′因子。细胞表面一样有性菌毛。66遗传变异专业知识专家讲座第66页

F－、F＋、Hfr、F′菌株之间关系67遗传变异专业知识专家讲座第67页（1）

F＋×F－杂交

杂交结果：供体细胞和受体细胞均成为F＋细胞，即：F＋×F－＝F＋＋F＋F＋菌株F因子向F-细胞转移，但含F因子宿主细胞染色体DNA普通不被转移。5、接合机制68遗传变异专业知识专家讲座第68页69遗传变异专业知识专家讲座第69页Hfr菌株F因子插入到染色体DNA上，所以只要发生接合转移过程，就能够把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。

Hfr+F-→Hfr+(F-)

（2）Hfr×F－杂交70遗传变异专业知识专家讲座第70页71遗传变异专业知识专家讲座第71页

Hfr菌株依然保持着F＋细胞特征，含有性菌毛，并象F＋一样与F－细胞进行接合。所不一样是，F因子先导区（leadingregion）结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体末端，因为转移过程常被中止，所以F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F－杂交后受体细胞（或接合子）大多数依然是F－。72遗传变异专业知识专家讲座第72页*中止杂交试验及染色体图绘制

73遗传变异专业知识专家讲座第73页

携带F′因子菌株称初生F′菌株。F′×F－与F＋×F－不一样：供体部分染色体基因随F′一起转入受体细胞。①与染色体发生重组；②继续存在于F′因子上，形成部分二倍体（次生F′菌株）；（3）F′×F－杂交74遗传变异专业知识专家讲座第74页75遗传变异专业知识专家讲座第75页三、转导（transduction）

经过完全或部分缺点噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段携带到受体细胞，经过交换与整合，从而使受体菌取得供体菌部分遗传性状。细菌转导类型普遍性转导不足转导完全转导流产转导高频转导低频转导76遗传变异专业知识专家讲座第76页

普遍性转导

由转导噬菌体携带了供体菌基因组中任何一部分染色体片段，当它感染受体菌时，使后者取得了这部分遗传性状现象。77遗传变异专业知识专家讲座第77页完全转导完全缺点噬菌体将DNA小片段从供体菌转移到受体菌，并发生基因重组。媒介—烈性或温和噬菌体过程烈性/温和性噬菌体宿主菌（供体菌）增殖（在装配时，偶然出现错误装配，即噬菌体蛋白衣壳包装有大小与噬菌体DNA相近宿主DNA片段）转导噬菌体供体菌裂解，释放出噬菌体（正常噬菌体+缺点噬菌体（10-6,完全缺点））感染受体菌转导噬菌体释放出供体菌DNA，与染色体基因重组78遗传变异专业知识专家讲座第78页完全普遍转导过程误包79遗传变异专业知识专家讲座第79页流产转导（1）由phage带入供体菌基因不交换，不整合，不复制，也不快速消失；（2）只进行转录，转译和性状表示（eg.产酶等）。80遗传变异专业知识专家讲座第80页不足转导经过部分缺点温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌并表示转导现象。供体菌基因→（部分缺失噬菌体）→受体菌

81遗传变异专业知识专家讲座第81页不足转导过程温和噬菌体感染整合到细菌染色体特定位点，宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧少数宿主基因偶然发生不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺点温和噬菌体把供体菌少数特定基因转移到受体菌中82遗传变异专业知识专家讲座第82页举例：

E.coliλ噬菌体，在其插入位点两侧为gal和bio基因，不正常切割时可包装入噬菌体外壳，形成缺点噬菌体，再感染时形成不足转导。83遗传变异专业知识专家讲座第83页1、低频转导（lowfrequencytransduction，LFT）温和噬菌体λ裂解时不正常切割：包含gal或bio基因（几率普通仅有10-6）缺点噬菌体在宿主细胞内能够象正常λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要裂解功效，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，经过DNA整合进宿主染色体而形成稳定转导子。84遗传变异专业知识专家讲座第84页2、高频转导（highfrequencytransduction，HFT）gal10－6galλ噬菌体感染E.coliλ噬菌体误切割LFT裂解物＋噬菌体（辅助噬菌体）感染E.coli双重溶源菌LFT裂解物

形成转导子频率很高，理论上可达50％，故称之为高频转导。85遗传变异专业知识专家讲座第85页50%50%形成阳性转导子形成噬菌斑gal－galgal－HFT裂解物感染E.coli（gal-）双重溶源菌HFT裂解物86遗传变异专业知识专家讲座第86页比较项目普通性转导不足转导转导发生自然发生人工