新版目的基因导入受体细胞

第三节重组子筛选在重组DNA分子转化、转染或转导过程中，普通仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采取适当方法从大量细胞背景中筛选出期待克隆子。概念克隆子转化子重组子新版目的基因导入受体细胞第1页将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持受体细胞统称为克隆子。把采取各种转化方法或转导方法取得克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在受体细胞称为转化子），现在这二者有通用趋向。含有重组DNA分子克隆子被称为重组子，假如重组子中含有外源目标基因则又称为阳性克隆子或期望重组子

。经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，取得所需阳性克隆子过程称为克隆子筛选。

新版目的基因导入受体细胞第2页一、遗传表型直接筛选法（一）依据载体选择标识初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一个或两种选择标识基因，在受体细胞内进行表示，展现出特殊表型或遗传学特征，作为筛选转化子依据。新版目的基因导入受体细胞第3页

普通做法是:将转化处理后受体细胞接种在含适量选择药品培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，依据菌落生长情况挑选出转化子。新版目的基因导入受体细胞第4页惯用选择标识基因主要是：抗性基因；

表示产物能够发光或使反应底物显色基因对应选择条件是：能够被抗性基因产物分解抗生素；能够使基因产物发光光线，或者是能够使基因产物显色试剂。新版目的基因导入受体细胞第5页选择培养基是：依据宿主细胞类型配置培养基，对于细菌受体细胞而言，通惯用LB培养基，在LB培养基中加入适量某种选择物，即为选择培养基。选择物：是由载体DNA分子上携带选择标识基因所决定。新版目的基因导入受体细胞第6页（一）依据载体选择标识初步筛选转化子（1）抗药性筛选（2）插入失活筛选法（3）插入表示筛选法（4）显色互补筛选法（5）利用汇报基因筛选植物转化细胞（6）利用遗传选择标识筛选哺乳动物转基因细胞新版目的基因导入受体细胞第7页（1）抗药性筛选新版目的基因导入受体细胞第8页新版目的基因导入受体细胞第9页正向选择方式新版目的基因导入受体细胞第10页注意：利用含一个选择药品选择培养基无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。非转化子呈Aps、Tcs转化子呈Apr、Tcr/s新版目的基因导入受体细胞第11页（2）插入失活筛选法新版目的基因导入受体细胞第12页双抗药性筛选双新版目的基因导入受体细胞第13页新版目的基因导入受体细胞第14页（3）插入表示筛选法利用外源目标基因插入特定载体后能激活筛选标识基因表示，由此进行转化子筛选。有些载体在设计时，在筛选标识基因前面连接上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游筛选标识基因才能表示。新版目的基因导入受体细胞第15页比如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因上游含有一段λ噬菌体DNACI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表示阻遏蛋白能够抑制Tcr基因表示。当外源DNA片段插入CI基因HindⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因妨碍解除而得以表示，故阳性重组子为Tcr表型。

质粒本身因为Tcr基因受妨碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段阳性重组子转化菌才能生长成菌落。新版目的基因导入受体细胞第16页（4）显色互补筛选法新版目的基因导入受体细胞第17页新版目的基因导入受体细胞第18页lacZ基因上缺失操纵基因区段突变体与带有完整近操纵基因区段β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。含有完整乳糖操纵子菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。假如在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失片段(lacZ’)．则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG培养基中得到转化子是蓝色菌落。新版目的基因导入受体细胞第19页lacZ’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失DNA片段，含lacZ’重组载体转化lacZ’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lacZ’互补型菌株本身为白色菌落。当lacZ’区插入外源基因后，再转化lacZ’互补型菌株，因为不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG培养基上也只能长成白色菌落。这么能够区分含外源基因和不含外源基因转化子。此方法主要用于原核生物。新版目的基因导入受体细胞第20页

α互补检测新版目的基因导入受体细胞第21页新版目的基因导入受体细胞第22页以显色剂x-gal作为选择物时:DNA对照组不应出现任何菌落；感受态细胞对照组长出菌落应全是蓝色；感受态细胞有效性对照组长出菌落中应有白色。其中一项不符，就有可能挑出假转化子菌落。新版目的基因导入受体细胞第23页（5）利用汇报基因筛选植物转化细胞汇报基因：系指其编码产物能够被快速地测定，惯用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表示活性一类特殊用途基因。在植物转基因研究中，在有选择压力情况下，可利用汇报基因在受体细胞内表示，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，汇报基因能够和一些目标基因组成嵌合基因，从汇报基因表示了解目标基因表示情况及推测基因调控序列。惯用汇报基因有抗生素抗性基因以及编码一些酶类或其它持殊产物基因等。

新版目的基因导入受体细胞第24页特征作为汇报基因，在遗传选择和筛选检测方面必须含有以下几个条件：

(1)已被克隆和全序列已测定；

(2)表示产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染细胞中无相同内源性表示产物；

(3)其表示产物能进行定量测定。新版目的基因导入受体细胞第25页①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子选择标识基因。②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标识基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子标识基因。新版目的基因导入受体细胞第26页④β-葡萄糖酸酶基因（gus）gus基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因转化子。因为植物细胞GUS本底非常低，所以广泛地应用于筛选植物转化子。尤其是gus基因3’端与其它结构基因连接产生嵌合基因仍能正常表示，产生融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中定位分析。新版目的基因导入受体细胞第27页⑤萤火虫荧光素酶基因（luc）luc表示产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+作用下，能够与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态氧化荧光素，能够用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生荧光，是当前研究动植物转基因很好用一个汇报基因。Luc基因检测十分快速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成危害，也没有内源荧光产生背景干扰，所以，Luc是一个理想汇报基因。新版目的基因导入受体细胞第28页⑥抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成份除草剂含有抗性。⑦冠瘿碱合成酶基因。主要包含胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒T-DNA区段。冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中表示产物能够催化一些特殊反应，经过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为汇报基因用于转植物基因细胞筛选。冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐步被其它更为理想汇报基因所取代。

新版目的基因导入受体细胞第29页（6）利用遗传选择标识筛选哺乳动物转基因细胞

在植物转基因研究中采取氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞筛选。惯用标识基因还有：--胸腺核苷激酶基因（tk）、--二氢叶酸还原酶基因（dhfr）--次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）--细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等。新版目的基因导入受体细胞第30页胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等表示产物直接或间接参加核苷酸合成代谢。这些基因缺失缺点型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加一些核苷酸培养基中才能生长。假如用这么缺点型细胞作为受体细胞，导入含有上述基因外源DNA，补充原来缺失基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，能够在不添加核苷酸培养基中正常生长。依据这一性质能够在不添加核苷酸培养基中筛选出转化子。新版目的基因导入受体细胞第31页三、核酸分子杂交检测法（p239）基本原理复性RNADNA新版目的基因导入受体细胞第32页待测核酸序列杂交双方用于检测已知核酸片段—探针新版目的基因导入受体细胞第33页新版目的基因导入受体细胞第34页

依据待测核酸起源以及将其分子结合到固相支持物上方法不一样。Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落（或噬菌体）原位杂交核酸分子杂交检测法分类新版目的基因导入受体细胞第35页又称DNA印迹杂交、SouthernDNA印迹杂交1、Southern印迹杂交经琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段↓转移到滤膜上↓

与标识DNA或RNA探针杂交↓放射自显影显杂交带基本原理：新版目的基因导入受体细胞第36页（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转印（5）变性解链（6）杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析

新版目的基因导入受体细胞第37页毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法核酸转移（印迹）方法新版目的基因导入受体细胞第38页毛细管虹吸印迹法湿滤纸高盐缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸玻璃板支持台容器重物新版目的基因导入受体细胞第39页利用核酸分子在电场中电泳作用将凝胶中DNA转移到固相支持物上。湿式电转移干式电转移电转移法新版目的基因导入受体细胞第40页尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极湿式电转移法新版目的基因导入受体细胞第41页真空转移法新版目的基因导入受体细胞第42页真空转移装置新版目的基因导入受体细胞第43页①硝酸纤维素膜（简称NC膜）优点：吸附能力强，杂交信号本底低缺点：DNA分子结合不牢靠，膜易碎裂，依赖高盐溶液惯用固相支持物新版目的基因导入受体细胞第44页②尼龙膜（Nylon）优点：结合单链，双链DNA能力比NC膜强，韧性高，可重复杂交缺点：杂交信号本底高惯用固相支持物新版目的基因导入受体细胞第45页凝胶滤膜转移RNA至膜上RNA分子甲醛变性电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）带有RNA片段凝胶转膜杂交、显影2、Northern印迹杂交新版目的基因导入受体细胞第46页两种印迹技术比较(P248)1\2\3\4新版目的基因导入受体细胞第47页3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交两种方法基本原理和操作步骤相同——

即经过特殊加样装置将变性DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。新版目的基因导入受体细胞第48页斑点杂交法新版目的基因导入受体细胞第49页狭缝式点样器新版目的基因导入受体细胞第50页

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、判别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能判别核酸分子量斑点及狭缝印迹杂交特点新版目的基因导入受体细胞第51页4、菌落（或噬菌斑）原位杂交基本原理直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上溶菌、变性DNA暴露并于滤膜原位结合与探针杂交新版目的基因导入受体细胞第52页溶菌、使DNA暴露洗菌体碎片和Pr使单链DNA牢靠结合在膜上新版目的基因导入受体细胞第53页操作用途Southern印迹杂交从转化子中提取总DNA，经酶切、电泳分带及变性，转移膜上，再用DNA探针与其杂交。操作麻烦。判定转化子中是否含有待检测重组DNA分子；判定待检测DNA分子大小。斑点印迹杂交把提取转化子总DNA直接点样到膜上，变性处理后再用DNA探针与其杂交。操作简单。只能区分总DNA中是否含有待检测重组DNA分子重组子菌落（或噬菌斑）原位杂交直接把菌落或噬菌斑印迹转移到膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用DNA探针与其杂交。操作简单。广泛地用于从基因组DNA文库和cDNA文库中筛选含目标基因重组子。三种筛选方法比较新版目的基因导入受体细胞第54页杂交探针——指含有一定序列核苷酸片段，它能与互补核酸序列复性杂交，而且经过适当标识进行检测。5、核酸杂交探针(自学)新版目的基因导入受体细胞第55页①同源或部分同源探针②总cDNA探针③特异性cDNA探针④人工合成寡核苷酸探针（1）核酸杂交探针种类新版目的基因导入受体细胞第56页理想探针标识物应满足条件：1)不会影响探针主要理化性质；2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；3)操作简便、省时．经济实用：4)化学稳定性高、易于长久保留；5)安全、无环境污染。惯用于分子杂交探针标识物分放射性及非放射性。（2）探针标识物新版目的基因导入受体细胞第57页放射性标识物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标识后产物，常见放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为惯用。标识物放射性检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。①放射性标识物新版目的基因导入受体细胞第58页非放射性标识物最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，能够较长时间保留使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针敏感性及特异性较差。当前已广泛应用非放射性标识物有：生物素(biotin)标识核苷酸、地高辛(digoxigenin)标识核苷酸荧光素(fluorescein)标识核苷酸②非放射性标识物新版目的基因导入受体细胞第59页（3）探针标识方法探针标识有体内标识及体外标识两种方法。体内标识法是以标识化合物作为代谢底物，经过活体生物或活细胞体内代谢完成核酸分子标识，比如在培养基中加入3H-胸苷，就能够标识到生长在该培养基中活细胞DNA分子上。体内标识法受各种原因限制，且标识活性不高，普通极少使用。新版目的基因导入受体细胞第60页体外标识包含化学法和酶法两种。化学标识法是利用标识物活性基团与核酸分子中某种基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标识物连接到探针分子上，含有简单快速、标识均匀特点，尤其适于制备非放射性标识物探针。酶标识法则是先将标识物标识在核苷酸上，然后经过酶促聚合反应使带标识核苷酸掺入到核酸序列中，取得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备全部放射性标识探针及部分非放射性标识探针。惯用酶法有DNA缺口平移标识法、DNA随机引物标识法、DNA末端标识法及PCR标识法等。新版目的基因导入受体细胞第61页①切口平移标识法

(nickthanslationlabeling)DNA聚合酶Ⅰ新版目的基因导入受体细胞第62页该法标识模板链新版目的基因导入受体细胞第63页②随机引物标识法

(randomprimedDNAlabeling)Klenow片段催化该法标识模板互补链随机引物是含有各种可能排列寡核苷酸片段混合物。新版目的基因导入受体细胞第64页随机引物：46使用随机引物标识探针普通长400-600个核苷酸，具各种序列，但都与模板互补。与切口平移法不一样是，该方法标识是模板互补链，而非模板本身。新版目的基因导入受体细胞第65页③末端标识法

(DNAterminallabeling)该法标识是线性DNA或RNA5’端或3’端，属非均一性标识。1)3’凸出末端加尾标识法：末端脱氧核苷酸转移酶将带有标识dGTP或dCTP加到DNA3’-OH端2)双链DNA3’隐蔽末端填充标识：（若反应体系存在全部与模板序列互补dNTP）以凸出序列为模板，Klenow酶或T4DNA连接酶催化补平3’末端（若一个dNTP带标识则成为探针）。3)5’末端标识：T4多聚核苷酸激酶将ATP标识γ-磷酸基团转移到游离5’-OH上。新版目的基因导入受体细胞第66页④PCR标识法(PCRlabeling)：标识一个dNTP⑤光敏标识法⑥化学衍生结合标识法：生物素和地高辛等非放射性标识物能够与事先经过化学修饰得到核酸衍生物愈加牢靠地结合，进行非放射性探针制备。惯用化学修饰反应包含磺化、转氨、溴化等反应类型。⑦交叉相连标识法：利用一些高分子化合物，如细胞色素c、组蛋白H1及大肠杆菌单链结合蛋白质等能与核酸结合特征，制备对应探针。新版目的基因导入受体细胞第67页四、DNA序列测定法（录像）

DNA序列测定，即核酸一级结构测定，简称DNA测序。对克隆DNA片段进行序列测定及分析:能够直观地判定出重组DNA分子中是否含有目标基因;能够取得目标基因编码序列和基因调控序列.这对目标基因表示及其功效研究含有主要意义。新版目的基因导入受体细胞第68页DNA序列分析当前用于测序技术主要有:Sanger等（1975）创造双脱氧链末端终止法Maxam和Gilbert（1977）创造化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是依据核苷酸在某一固定点开始，随机在某一个特定碱基处终止，产生A，T，C，G四组不一样长度一系列核苷酸，然后在尿素变性PAGE胶上电泳进行检测，从而取得DNA序列。当前Sanger测序法得到了广泛应用。新版目的基因导入受体细胞第69页1DNA化学降解测序法DNA化学降解测序法也叫Maxam-Gilbert测序法基本原理是，将待测DNA分子进行末端放射性标识，然后置于4组独立化学反应体系中分别进行部分降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。经过化学降解一段时间后，在每一组反应体系中，生成各种不一样长度、一端为放射性标识固定寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后能够读出待测DNA分子碱基序列。新版目的基因导入受体细胞第70页（2）碱基切割反应体系进行碱基特异性化学切割反应试剂是硫酸二甲酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。硫酸二甲酯、肼（联氨）——碱基进行化学修饰；哌啶——从修饰碱基处断裂核苷酸链。在不一样酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不一样组合能特异地切割核苷酸序列中特定碱基，降解待测模板DNA分子。新版目的基因导入受体细胞第71页硫酸二甲酯（DMS）：G；pH2甲酸哌啶：

G+A;肼（NH2NH2）：

C+T;肼（NH2NH2）+高盐：C新版目的基因导入受体细胞第72页1、待测模板制备3、待测模板DNA分子序列分析2、化学降解待测模板DNA分子测序步骤（3）DNA新版目的基因导入受体细胞第73页序列读取是逆电泳方向进行DNA新版目的基因导入受体细胞第74页化学降解测序法不但适于单链DNA，也适于双链DNA测序，主要用于研究DNA一级和二级结构、DNA甲基化位点测定和DNA-蛋白质相互作用等方面，结果准确可靠，是DNA测序基本方法之一。它缺点是一轮反应所能测定模板DNA长度只有250bp左右，若测定大片段DNA分子时，操作较为繁琐费时。另外，化学降解测序法不能在载体上直接进行，标识后模板DNA分子难以纯化。新版目的基因导入受体细胞第75页2DNA双脱氧链终止测序法双脱氧链终止测序法是由Sanger等在加减法基础上建立一个简单快速DNA序列分析法，故也称为Sanger测序法。有时又称为引物合成法，或酶促引物合成法，因为该法是以待测DNA分子为模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，利用适当DNA合成引物进行DNA互补链合成来完成测序工作。新版目的基因导入受体细胞第76页基本原理：DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出对应DNA互补链，但在反应过程中，假如2’，3’-双脱氧核糖核苷三磷酸底物（ddNTP）掺入到寡核苷酸链3’端，DNA链延伸反应即被终止。ddNTP——链终止核苷酸（1）基本原理新版目的基因导入受体细胞第77页新版目的基因导入受体细胞第78页新版目的基因导入受体细胞第79页在4个特定反应体系中分别加入一个ddNTP反应底物（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶I、一定浓度dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一个是带32P放射性标识），DNA链合成随机终止于某一特定ddNTPs。最终经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出待测DNA模板碱基序列。双脱氧链终止测序法准确度较高，绝大多数以单纯测定DNA序列为目标试验室均采取此法。此法读取碱基序列是待测DNA模板互补链，而非模板链本身。新版目的基因导入受体细胞第80页ddNTP

新版目的基因导入受体细胞第81页新版目的基因导入受体细胞第82页新版目的基因导入受体细胞第83页新版目的基因导入受体细胞第84页（2）双脱氧核糖核苷三磷酸作用机制

2’，3’-双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）分子结构式与2’-脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）极为相同，惟一区分是，ddNTP在脱氧核糖3’位置上缺乏一个羟基。在DNA链合成过程中，ddNTP能够利用其5’-磷酸基团与DNA链上游离羟基基团形成磷酸二酯键而使链得以延伸，不过因为ddNTP缺乏3’-0H基团，不能与下一个底物分子5’-磷酸基团进行反应，所以新生寡核酸链一旦加入ddNTP，DNA链合成就会终止。新版目的基因导入受体细胞第85页新版目的基因导入受体细胞第86页（3）待测模板DNA分子制备限制性核酸内切酶消化切割形成DNA小片段↓随机地克隆到一个适当载体分子上↓经转化筛选后得到含有同一起源DNA片段重组子克隆后代↓以此大量制备重组DNA分子，直接用于DNA测序需要采取DNA分子克隆方法制备模板DNA：新版目的基因导入受体细胞第87页因为新生DNA链合成反应是从引物3’端定向进行，无须将待测DNA片段从载体上切下。实际上，载体存在不但不会影响测序结果，反而有利于测序进行，因为在实际操作中，引物往往是与载体克隆位点两侧序列互补，这么能够测定完整DNA序列。新版目的基因导入受体细胞第88页

M13载体能克隆单链DNA分子，制备产物可直接用作引物合成反应中单链模板，同时，因为待测DNA片段均被克隆在M13载体同一个特定区段内，全部待测DNA片段，都能够使用同一个引物，即M13载体克隆位点两侧通用引物（universalprimer）进行DNA链合成延伸，防止了因合成和分离各种不一样引物而造成许多麻烦。所以，M13载体双脱氧链终止法当前已经成为一个普遍采取快速DNA序列分析法。新版目的基因导入受体细胞第89页1985年Chen和Seeburg为了提升DNA测序速度建立。该法是将待测定DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形双链质粒DNA按双脱氧链终止法测定模板DNA序列。因为通常使用质粒是PUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。这种方法最大优点是，它无须将DNA克隆到M13载体分子上，而是直接用碱变性双链闭合环形重组质粒DNA作为模板进行序列分析，所以比M13法更为简单快速，实用价值高。☆针对双链DNA模板进行双脱氧链终止测序法新版目的基因导入受体细胞第90页（4）测序反应物合理应用双脱氧链终止测序法操作关键：是ddNTP与dNTP用量百分比，二者较为理想分子比在1：3至1：4之间。大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段、测序酶（经过改造T7噬菌体聚合酶）、TaqDNA聚合酶DNA序列分析中通常采取[α-35S］dATP代替[α-32P］dNTP，方便取得更高分辨率。新版目的基因导入受体细胞第91页3大片段DNA测序策略

DNA测序通常包含克隆、测序反应和读序三个步骤。前述两种DNA测序方法中，一次测序能直接读出DNA序列长度受到聚丙烯酰胺凝胶分离效果限制，普通情况下，最大程度不超出350个碱基序列。所以，对于较大DNA片段而言，必须将其分成较小片段分别测序，才能取得完整碱基序列。

选择恰当测序策略将直接关系到大片段DNA或基因组DNA序列分析工作效率。新版目的基因导入受体细胞第92页①随机克隆策略又叫鸟枪法克隆策略，先将克隆DNA片段用超声波打断或DNA酶Ⅰ切断，随机亚克隆到M13载体上，分别进行DNA序列测定，然后利用计算机进行数据分析，排出完整DNA序列。鸟枪法缺点随机亚克隆易造成序列重复测定，也易丢失一些序列；测序及测序后数据处理和分析工作量大，并需要计算机帮助进行排序才能得到完整序列。新版目的基因导入受体细胞第93页新版目的基因导入受体细胞第94页②引物步移策略将待测DNA片段克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片段一端开始逐步进行序列测定，直到另一端为止。新版目的基因导入受体细胞第95页新版目的基因导入受体细胞第96页引物步移法克服了鸟枪法盲目性，并省去亚克隆制备繁琐步骤，也减轻了随即数据分析工作量。但因为测定下一段序列前要预先知道上游序列碱基序列，才能合成适当引物进行测序，所以该策略难以自动化操作。另外，引物合成费时费劲，再加上当前惯用质粒载体不易纯化等也都影响了该法实施。最近研究表明：随机引物可作为引物步移法中测序引物，比如采取线性连接3条6碱基随机引物即可很好地引导测序反应，这些结果为引物步移法自动化带来可能。新版目的基因导入受体细胞第97页③定向缺失克隆策略利用核酸外切酶Ⅲ、Bal31或T4DNA聚合酶等酶解方法，从克隆DNA片段一侧进行不一样时间定向缺失，逐步缩短DNA片段大小，分别回收并环化DNA缺失片段，使DNA片段被保护一侧引物结合位点与缺失不一样长度一侧连接重组，转化筛选后得到一系列由待测DNA片段定向缺失后形成嵌套重组子，然后利用引物结合位点逐一测定这些嵌套重组子中待测DNA模板，最终依据重合序列将不一样片段序列拼接为完整DNA片段序列。新版目的基因导入受体细胞第98页利用ExoⅢ能特异性起始切割5’凸出端或平末端双链DNA，而不能有效切割3’凸出端双链DNA特征，构建待测DNA定向嵌套缺失。新版目的基因导入受体细胞第99页4、DNA测序技术发展第一，非放射性标识检测物使用第二，DNA测序自动化：1是测序过程中一些详细步骤机械化和自动化，2是高度集成自动化测序仪创造及应用第三，计算机在DNA测序中应用：大规模测序计划在很大程度上依赖于计算机程序对原始数据进行分类、整理和排序，尤其是在随机测序策略中，采取计算机辅助分析，大大加紧了DNA测序发展进程。新版目的基因导入受体细胞第100页第四，现有技术其它改进。主要包含：增加每块胶上泳道数；采取新型凝胶和电泳技术；改进光学检测系统；提升测序聚合酶催化效能等。其目标是大大加紧测序速度，提升测序反应灵敏度及准确性，降低测序反应对模板质量要求，简化模板制备程序等。新版目的基因导入受体细胞第101页DNA测序方法分为两类：一类是基于凝胶电泳技术测序法，包含当前普遍采取手工DNA测序技术、自动化DNA测序技术、毛细管凝胶电泳激光荧光法、阵列毛细管电泳激光荧光法和超薄层凝胶板电泳激光荧光法等；另一类是不依赖于电泳分离直接测序法，包含质谱法、原子探针法、杂交法和流动式单分子荧光检测法等。新版目的基因导入受体细胞第102页（1）以凝胶电泳为基础测序方法①DNA全自动序列分析系统（ALFsystem）DNA自动测序采取荧光替换放射性核素标识是实现DNA序列分析自动化基础。用不一样荧光分子标识四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，经过四种激光激发不一样大小DNA片段上荧光分子使之发射出四种不一样波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基排列次序。新版目的基因导入受体细胞第103页②超薄层板凝胶电泳（ultra-thingelelectrophoresis，UGE）激光荧光法在电泳方式方面有2处改进：1是超高压电场使用，它能够大幅度提升电泳速度；2是超薄凝胶使用，因为降低了凝胶厚度，不但提升了电泳速度，还能够提升电泳条带分辨率，使一次性阅读由原来500个碱基上升至1000个碱基，总效果是测序速度提升到8000bp／h以上。在电泳结果检测方式方面，以激光荧光检测法取代了传统放射自显影检测法，既杜绝了放射性核素带来危害，也便于自动化操作。新版目的基因导入受体细胞第104页③PCR测序技术第一，利用PCR技术直接从大DNA片段或基因组DNA中扩增取得足够量待测DNA模板，从而省去亚克隆等繁琐步骤。当前，不对称PCR、单链PCR、固相PCR以及循环PCR等新PCR技术都已应用到DNA测序中。第二，经过PCR技术进行重合群排序。将由重合群末端序列确定引物逐一配对，以待测大片段DNA为模板进行PCR，如能扩增出阳性条带，便说明这两个重合群相邻。重合群次序一经确定，便可利用PCR扩增重合群间DNA片段。第三，利用PCR技术进行DNA链终止测序反应，这一过程被称为循环测序。循环测序是在模板DNA分子过少时，用耐高温Taq酶代替DNA聚合酶进行酶法测序。在测序反应中，首先模板DNA分子得以扩增，另首先ddNTP插入造成以特定ddNTP结尾长短不一样DNA片段。经过电泳分离便可取得待测DNA分子碱基序列。循环测序优点有：大大降低了模板DNA用量；重复变性、复性、链延伸循环可使双链DNA酶法测序高效进行；初始阶段加入试剂后无须在中途补充，可实现自动化。新版目的基因导入受体细胞第105页

④毛细管及阵列毛细管电泳激光荧光法与普通凝胶电泳相比，毛细管凝胶电泳具备很多优势：第一，高效、快速。毛细管内径普通在25～100pm，比表面积大，散热快，可使用较高电场强度，大大提升了分析速度和分辨率。第二，所需样品量少，灵敏度高。采取电动进样或压力进样，样品量仅为1-50ul，普通紫外检测器可检测10-13-10-15mol，激光诱导荧光检测可达10-18-10-21mol。第三，在线检测。利用检测窗口直接进行柱检测，不受凝胶长度影响。第四，操作自动化、重复试验误差低。所以，利用毛细管凝胶电泳进行DNA测序，分辨率极高，其关键在于选择适当毛细管长度、电场强度、凝胶聚合物浓度及温度原因等，以到达将一个碱基大小差异DNA片段顺利分离开来目标。新版目的基因导入受体细胞第106页（2）非电泳分离测序技术①杂交法（SBH）SBH基本原理是，用特定长度含有全部可能碱基序列寡核苷酸群体，与未知序列特点数目标DNA片段杂交，依据一些寡核苷酸探针形成完全双链推知目标DNA碱基序列。新版目的基因导入受体细胞第107页利用共价结合在寡核苷酸3’或5’端衍生物与玻璃板或凝胶结合，形成固定寡核苷酸小区；不一样碱基组合寡核苷酸小区排列在一起形成探针点阵，组成DNA测序芯片或称为基因芯片、寡核苷酸矩阵芯片。芯片中寡核苷酸小区数目取决于寡核苷酸片段长度，以八聚体单链DNA探针为例，包含全部可能4种碱基全部排列序列共计48=65536种，所以在芯片上寡核苷酸小区数目为65536个，每一个寡核苷酸小区则代表了一个已知序列探针。每一个探针序列与其所处位置对应关系是已知，测序时，只须将待测DNA样品变性解链，在单链DNA片段末端上共价标识一个荧光分子，然后与基因芯片进行复性杂交。经适当清洗后，与探针完全杂交单链DNA荧光分子在特定波长激光束照射下，发射出一定波长荧光，然后再由荧光扫描仪将基因芯片上全部方格点阵进行荧光扫描检测，并将荧光发射是否正负信号传输到电脑，最终依据发射荧光探针序列排出待测DNA样品全序列。新版目的基因导入受体细胞第108页新版目的基因导入受体细胞第109页②原子探针显微镜法扫描隧道显微镜（STM）和原子显微镜（AFM）等新技术发展，使快速、高分辨、直接观察DNA分子构象成为可能。STM采取了相当于原子直径导电探针扫描样品表面，经过连续测量移动探头与分子表面之间形成隧道电流，确定样品三维图像。AFM则是经过测量探针和DNA样品表面作用力来确定分子表面形状，并不要求样品导电。当前，应用STM已成功地观察到DNA双螺旋结构和单个碱基对以及单链分子中单个核苷酸，所以能够直接从DNA单链上读取碱基序列。依据扫描速度，DNA测序能力可达1000bp／min以上。新版目的基因导入受体细胞第110页③流动式单分子荧光检测法美国LosAlamos国家试验室建立一个快速DNA测序新技术，可对单个分子进行检测。基本原理是，对模板DNA片段上4种碱基分别标识上不一样荧光基团，然后置于液体系统中，用水流载带DNA片段流动，利用外切酶快速逐一地切断DNA中标识单个碱基，经过激光荧光检测碱基类型，便可得到模板DNA序列。据报道，此法测序速度可达100～1000bp/s，而常规自动测序仪最快阅读速度仅为0.1bp/s。存在主要问题是怎样快速酶切单个荧光标识核苷酸分子以及怎样用4种不一样荧光基团标识不一样4种碱基等。新版目的基因导入受体细胞第111页基本过程与菌落分子杂交法相同，但该法使用抗体探针，而非DNA探针来判定目标基因表示产物。免疫学检测法含有专一性强、灵敏度高特点，只要有一个拷贝目标基因在克隆子细胞内表示合成蛋白质，就能够检测出来。前提条件是克隆基因可在宿主细胞内表示，而且有目标蛋白抗体。依据试验伎俩不一样，免疫学检测法能够分为抗体测定法和免疫沉淀测定法等类型。四、免疫化学检测法（自学）新版目的基因导入受体细胞第112页（1）放射性抗体测定法（2）非放射性抗体测定法1、抗体测定法新版目的基因导入受体细胞第113页基本依据一个免疫血清中含有各种类型免疫球蛋白IgG分子，这些IgG分子分别与同一抗原分子上不一样抗原决定簇特异性结合。抗体分子或其某部分可牢靠地吸附在固体支持物（如聚乙烯塑料制品）表面上，所以不会被洗脱掉。经过体外碘化作用，IgG抗体会快速地被放射性125I标识上。（1）放射性抗体测定法新版目的基因导入受体细胞第114页放射性抗体测定法操作过程新版目的基因导入受体细胞第115页当前所采取免疫学检测方法中，更多是先将待检测菌落或噬菌斑按原位印迹到硝酸纤维素膜等固相支持物上，然后裂解细胞，使目标蛋白抗原结合到硝酸纤维素膜上，深入与对应抗体（即第一抗体）反应，形成抗原-抗体复合物。反抗原-抗体复合物检测，既可采取125I标识第二抗体直接检测，也可采取125I标识A蛋白进行间接分析。直接检测法中，针对不一样第一抗体，应分别标识对应第二抗体进行检测；间接分析法中，只须标识一个A蛋白分子便可检测各种不一样第