安徽三大流域克氏原螯虾种群遗传结构分析

安徽三大流域克氏原螯虾种群遗传结构分析

外生物入侵是对全球生物多样性的威胁之一（simberloff，2005）。为了有效控制其入侵带来的危害,必须了解入侵途径、扩散传播、成灾机制(Kolbeetal.,2008),这需要从不同的层次上开展研究(Zalewskietal.,2009)。景观格局影响种群的基因流和空间遗传结构(Sorketal.,1999;Maneleal.,2003;Kitamotoetal.,2005)。研究物种在不同景观中的基因交流,可以了解物种在不同环境中的适应性和扩散规律(Yasudaetal.,2009)。传统种群分析方法在认识入侵生物的基因交流、引入来源、扩散规律等方面有许多局限性,而分子标记手段可以有效分析有关外来物种入侵路径及其遗传变异程度的相关信息(Sakaietal.,2001)和物种的扩散进程(Lee,2002;Barbaresietal.2003)。克氏原螯虾(Procambarusclarkii)隶属于十足目螯虾科原螯虾属,原产于墨西哥东北部和美国中南部(Huner,1988),现在已经扩散到世界各地(Geigeretal.,2005;Gherardi,2006;Hernándezetal.,2007)。该种于1929年由日本引入我国南京(解焱等,2001)20世纪80年代前后迅速扩散,目前我国大部分省区均有分布(李顺才等,2005),对渔业和水生生物产生了严重的影响(李振宇和解焱,2003;武正军等2008)。国外学者先后使用RAPD(Barbaresietal.2003)、线粒体细胞色素I(COI)(Barbaresietal.2007)和微卫星(Belfiore&May,2000;Barbaresieal.,2007)等分子标记研究了克氏原螯虾在当地的入侵途径和路线。然而我国对其种群扩散过程、机制和种群遗传结构的研究十分有限(刘炜,20081材料和方法1.1采样点和测量方法长江、淮河和新安江形成了安徽三大水系。江淮之间小型水域较多;长江与新安江之间由黄山山脉隔离,不存在小型水域,水系之间交流较少。我们根据三大流域水系特征,共设置包括淮河流域、江淮之间、长江流域和新安江流域在内的4个区域于2008年4月至2009年9月进行野外采样。采样点共9个,包括淮河流域的城东湖(Cd);江淮之间的肥西(Fx)、合肥(Hf)和巢湖(Ch);长江沿江的菜子湖(Czh)、升金湖(Sj)、东至(Dz)、望江(Wj)和新安江(Xa)(图1和表1)。样本采集后测量体长,称取湿重(李浪平等,2006)。样本体长范围为5.38–8.96cm,体重为10.42–47.79g。样本采集后用无水乙醇或95%乙醇浸泡保存备用。1.2基因组dna的提取取虾尾部肌肉约0.2g,剪碎后放入2mL的离心管中,采用常规酚–氯仿法抽提基因组DNA(Sambrook&Russell,2001)。抽提产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后,–20°C保存备用。1.3数据的获取、分析和系统树构建根据已发表的克氏原螯虾微卫星位点(Belfiore&May,2000;Zhu&Yue,2008),选择其中9对扩增条件较好、多态性高的引物,分别用荧光基团(FAM,TAMRA或HEX)在5’端进行标记(表2)。荧光引物委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为10μL:含模板DNA约10–50ng,Mg利用GeneMarker1.85软件(/GeneMarker.html)读取微卫星位点数据,汇总至Excel,使用TheExcelMicrosatelliteToolkit3.1.1软件(Park,2001)进行初步统计和数据格式的转换,用GENETIX4.05.2软件(http://www.genetix.univ-montp2.fr/genetix/genetix.htm)统计分析整体样本和各采样地种群微卫星位点的等位基因数(N利用Populations1.2.30(http://bioinformaticsorg/~tryphon/populations)和MEGA4.0(Kumaretal.2008)进行遗传距离分析和系统树构建。系统树构建采用NJ(neighbor-joining)法(Saitou&Nei,1987),分支处的自展检验次数设定为1,000次。使用Structure2.3.1软件(Pritchardetal.,2000)对9个采样点进行潜在亚种群(inferredsubpopulations)分析,分析克氏原螯虾的遗传结构,计算本研究种群的最可能亚种群数。选择混合模式运行程序(admixturemodel),假定8个潜在亚种群,导入按采样地获得的种群数据,每个K值(thenumberofsubpopulations,潜在亚种群数)计算7次,预热(burn-in)次数为100,000,随后进行1,000,000次重复的正式计算。2结果2.1单个位点的等位基因数9个多态位点从182个样本中共获得等位基因177个,单个位点的等位基因数(N9个微卫星座位的多态信息含量范围为0.51–0.85,表现出较强的多态性(表2)。9个采样点的亚种群内个体的固定系数(F2.2亚种群聚类分析利用微卫星距离矩阵,以NJ法构建的182个克氏原螯虾个体的系统树大致聚为6个较大的分支。相同采样点的个体聚为一支,一些地方种群的个体则散布于不同的支中(图2)。Structure分析结果显示,在ΔK检验中,当K=2时,出现较高峰值(图3),说明最有可能的亚种群数为2。当K=2时,城东湖、东至、望江和新安江种群聚为一组;合肥、肥西、巢湖、菜子湖和升金湖种群聚为一组;K=3时,城东湖和新安江种群仍聚为一组;当K=4时,城东湖和新安江种群分开成两组(图4)。地方种群间的平均基因流N3讨论3.1引入我国的克氏原螯虾种群的多样性入侵种群往往由于瓶颈效应或遗传漂变导致遗传多样性的降低(Friaretal.,2000;Tsutsuietal.,2001),但一些物种在入侵后,种群遗传多样性并没有显著降低(Faconetal.,2003;Hassan&Bonhomme,2005)。例如入侵美国北部的斑驴蚌(Dreissenabugensis)和斑马蚌(D.polymorpha)(Stepienetal.,2002),以及入侵我国南京等地的空心莲子草(Alternantheraphiloxeroides)种群均具有较高的遗传多样性(史刚荣和马成仓,2006)。这一现象可能与以下几种因素有关。首先,在引入模式上,相同来源地或不同来源地的多次引入(Bergetal.,2002;Kolbeetal.,2004;Barbaresietal.,2007;褚栋等,2007)或单次引入大量的个体可能导致种群具有较高的遗传多样性(Stepienetal.,2002;Barbaresietal.,2007;褚栋等,2007;Herborgetal.,2007)。其次,入侵物种成功进入新的环境后通过杂交或变异,遗传多样性得以增高(徐汝梅和叶万辉,2003;陈毅峰和严云志,2005;史刚荣和马成仓,2006;褚栋等,2007)。本研究中所选用的9个微卫星位点在不同地方种群中均具有较为丰富的遗传变异,9个地方种群的平均期望杂合度为0.56–0.76。对比以往研究中利用微卫星分子标记的结果,高于长江下游(盱眙、合肥和南昌种群的平均期望杂合度分别为0.53590.4024和0.5208)(王长忠等,2009);总的期望杂合度为0.78,高于部分东部地区(东部6个地方种群总的期望杂合度为0.63)(刘炜,2008)一般认为我国的克氏原螯虾来源于一次引入(Yueetal.,2010)。我国学者对克氏原螯虾种群分布和扩展的调查较少,仅有少量局部调查(解焱等2001)。后续的研究多是文献的引用和小范围补充调查(李振宇和解焱,2003;李顺才等,2005;武正军等,2008),缺乏对其来源和扩散规律的全面了解,甚至不能排除有多次引入的可能。参照克氏原螯虾在意大利的种群遗传学研究(Barbaresietal.,2003),推测首次引入我国的克氏原螯虾种群数量较大,具有较高的遗传多样性水平,或者入侵我国克氏原螯虾种群可能存在未检测到的多次重复引入,可能是造成克氏原螯虾种群具有较高遗传多样性的原因。克氏原螯虾本身具有极强的繁殖力(Geigeretal.,2005),由于经济捕捞严重,经历着较大的生存压力,也可能在入侵后产生了迅速的遗传变异。深入阐明克氏原螯虾入侵后的遗传变异来源有待于后续种群生态学和种群遗传学研究。3.2华伦得效应检验本研究发现多数地方种群具有较高的私有等位基因,克氏原螯虾种群各个位点都显示出显著的杂合子不足。杂合子不足在其他物种中的存在也较为普遍(Valles-Jimenezetal.,2005;Morrisonetal.,2009;Serranoetal.,2009)。这种现象可能由非随机交配(non-randommating)或近交、无效等位基因(nullalleles)、亚种群分化或华伦得效应(Wahlundeffect)(Herborgetal.,2007)和其他因素(Gaffneyetal.,1990;Castricetal.,2002)等造成。当种群在全部位点中的Hardy-Weinberg平衡检验所获得的P值均接近于0时,所检测到的偏离不是来自于随机事件(DeAssisetal.,2009)。我们选用的位点在以往的研究中是符合Hardy-Weinberg平衡的(PclG33和PclG48未检测)(Zhu&Yue,2008),说明种群对平衡的偏离并不是来自于无效等位基因。华伦得效应是指当一个大种群是由多个遗传结构不同的亚种群所组成时,把全部的个体合并为一个种群计算的等位基因频率与各个亚种群分别计算再予平均所得的结果会有差异(Li,1995)。即使每个亚种群内个体都是随机配对,当把全部个体并为一个种群计算时,将产生纯合子偏高的情形(Hedrick,1984),从而造成结果上出现类似于近交的现象。我们计算不同地方种群的固定系数(F克氏原螯虾个体的繁殖能力很强,抱卵数量多(Huner,1988)。幼体在成长阶段附着在母体腹部的繁育方式,保证了后代很高的成活率。仔虾在脱离母体后,在营独立生活前仍会在母体周围生活相当一段时间(郭晓鸣和朱松泉,1997),可能会造成近交的发生(Yueetal.,2010)。其他淡水螯虾中也发现非随机交配的现象(Villanelli&Gherardi,1998)。克氏原螯虾具有较高的经济价值,长期大量的人为捕捞造成其种群数量锐减,种群世代间的基因比例变化较大。当一个种群发生近交时,其所有位点会较为显著地出现连锁不平衡(Castricetal.,2002)。本研究中发现所有位点的F-统计值一致性较高,都表现出显著的杂合子不足,地方种群间的固定系数(F3.3种群遗传多样性在不同的环境条件下,物种对环境存在适应性梯度(Manningetal.,2004)。种群所处环境中的景观特点可以影响种群的基因流和空间遗传结构(Sorketal.,1999;Maneletal.,2003;Kitamotoetal.,2005)。目前,克氏原螯虾在各地的扩散路线和地方种群间的基因流仍然不明确(李振宇和解焱,2003;Yueetal.,2010)。以往的研究表明南京种群与南昌种群的遗传距离比与盱眙种群的距离近(王长忠等,2009),本研究中各种群的遗传多样性水平由高到低分别是:望江、东至、城东湖、升金湖、菜子湖、巢湖、新安江、合肥、肥西。望江种群采自于华阳河入长江口,东至种群采自于香口乡长江沿岸,城东湖、升金湖种群采自于各湖湖边,合肥、肥西等地的种群均在小溪流或较小水库,证明克氏原螯虾种群遗传多样性水平与种群采样点和大水系之间的距离具有一定的关系。Structure检验中,K=2时潜在亚种群聚类表明合肥、肥西、巢湖、菜子湖、升金湖聚为一群,提示在长江沿岸及以北地区和淮河以南水系间的个体存在一定的基因交流(图4)。从系统树上看,虽然系统关系较为无序,相同地方种群的多数个体仍聚在一起,望江种群与东至种群部分个体分布于同一大支(图2)。在距离隔离格局计算中,地理距离与地方种群分化呈显著线性相关(r=0.33,P<0.05)。克氏原螯虾具有较强的扩散能力,在游荡期(wanderingphase)内,4天的时间可以移动17km(Gherardi&Silvia,2000),王长忠等(2009)认为南京种群和南昌种群采集点有长江贯通,导致两群体间的基因交流较大。可见水系间的交流是其扩散的