酶工程酶制剂制备

酶工程酶制剂制备酶工程酶制剂制备第1页

——（细胞破碎）

——发酵液预处理

——酶液脱色

——酶蛋白初步纯化与浓缩

——（酶蛋白提纯与精制）

——酶制剂成形。CH4.1酶制剂工业提取方法酶工程酶制剂制备第2页注意事项

基础标准：预防生物分子变性、降解1．控制适当pH2．控制低温3．注意提取过程中溶液环境4．预防提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基酶工程酶制剂制备第3页CH4.1酶制剂工业提取方法

1细胞破碎方法对于胞内酶提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内酶蛋白游离出来，常见破碎方法有以下几个：

1.1机械破碎法：1.2物理破碎法：1.3化学方法：①机械捣碎法：10000转/分。②研磨法：只适合于试验室小规模操作。③匀浆法：细胞破碎程度较高，规模小。①温差破碎法：②超声波（>20kHz）裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10℃，3-10min；

当前有效化学方法主要是加入表面活性剂法常见有：特里顿X-100和吐温（Tween），其主要是破坏细胞膜结构，增加膜通透性。此法在试验室和生产上已成功应用

酶工程酶制剂制备第4页CH4.1酶制剂工业提取方法

2发酵液预处理2.1发酵液絮凝发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液极难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。

发酵液预处理常见方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常见絮凝剂有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（PolystyreneSulfonate）；絮凝剂加入，主要有以下三方面作用：①改变发酵液中悬浮粒子物理特征，如加大粒子大小，提升粒子硬度等；②使一些可溶性胶体物质变成不溶性沉淀粒子；③降低发酵液黏度。

2.2酶液脱色这一步骤可依据酶制剂要求而定，普通工业酶制剂允许含有起源中色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、分析用酶等必须进行脱色处理；当前大个别工业酶制剂都要进行脱色处理过程。常见脱色剂有活性炭和离子交换树脂。活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱色同时，也有个别酶蛋白被吸附掉了；离子交换树脂基础上在脱色同时，不吸附酶蛋白。

我国生产了一个脱色专用树脂：通用１号脱色树脂。在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素。树脂再生方便，再生条件是：先用５％NaOH洗脱色素，待色素洗脱洁净后，用蒸馏水洗到中性，再用5%HCl（二倍树脂床体积）中和树脂，再用蒸馏水洗到pH5.0-5.5为止。酶工程酶制剂制备第5页CH4.1酶制剂工业提取方法

3酶蛋白初步纯化与浓缩

3.1盐析法[1]盐析基础原理：蛋白质在水中溶解度与其所带净电荷多少呈正相关，即蛋白质极性越强，其溶解度越大，溶液中离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质水合程度，降低其溶解度；另首先，液相中离子电荷个别地中和蛋白质分子上电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；另外，溶液中盐离子引发水分子极化和定向排列降低水分活度；以上三方面作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。

在盐溶液里，蛋白质溶解度对数值与溶液里离子强度成线性关系，大家总结了以下经验公式：

logS=β-Ks.μS:Protein溶解度g/l；β为溶液离子强度为零时logS，

β值受蛋白质性质、盐离子种类、溶液温度和pH值影响；

Ks为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子种类不一样而不一样；μ为溶液离子强度。

[2]盐析基础方法：蛋白质盐析方法主要有以下两种：

Ks盐析法：即蛋白质溶液pH值和温度固定不变，改变溶液盐浓度（离子强度），以到达沉淀蛋白作用；此法常见盐是硫酸铵。

β盐析法：是在一定离子强度下，改变溶液pH值和温度，以到达蛋白沉淀目标。在实际工作中，常见是Ks盐析法，利用不一样饱和度(NH4)2SO4浓度，这么不一样蛋白质析出沉淀(NH4)2SO4

浓度不一样；经过这种方法可将个别杂蛋白分离出去，到达浓缩酶蛋白目标。[3]盐析曲线：按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，得一条以下曲线：盐浓度（饱和度）酶蛋白溶解度盐溶效应：[4]详细操作方法：饱和溶液法:干粉加入法:[5]影响盐析原因：

温度：

pH：[6]盐析后脱盐处理透析法：凝胶过滤法：酶工程酶制剂制备第6页调整硫酸铵溶液饱和度计算表酶工程酶制剂制备第7页CH4.1酶制剂工业提取方法

3酶蛋白初步纯化与浓缩3.2有机溶剂沉淀法

除用盐析法沉淀酶蛋白外，还能够用有机溶剂沉淀酶蛋白，当前选取有机溶剂主要有丙酮和乙醇，而且丙酮沉淀效果比乙醇好，但丙酮价格高，蒸馏回收困难，所以当前多采取乙醇作沉淀剂。

沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多原因影响，溶液离子强度、温度、pH值等都影响蛋白质析出，低浓度盐离子有促进蛋白质溶解作用，即所谓盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇浓度要增加；温度升高蛋白质溶解度增加，沉淀酶蛋白需要乙醇浓度增加；pH值影响因不一样蛋白质而不一样，普通情况下，当溶液pH值与酶蛋白等电点一致时，需要乙醇浓度最低，偏离酶蛋白等电点越远，酶蛋白所带电荷越多，蛋白质溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。普通作为沉淀剂乙醇浓度是95%，沉淀不一样酶蛋白需要乙醇量稍有差异。如沉淀枯草杆菌淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积发酵液加0.2—0.8体积乙醇；当沉淀蛋白酶时，加0.8—1.1体积乙醇沉淀出主要是中性蛋白酶，加1.1—1.4体积乙醇时，沉淀出主要是碱性蛋白酶。对于每一个酶蛋白沉淀要求乙醇适宜浓度需要试验确定。酶工程酶制剂制备第8页几个主要沉淀方法比较酶工程酶制剂制备第9页CH4.1酶制剂工业提取方法

3酶蛋白初步纯化与浓缩3.3

喷雾干燥法

此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定不足，在喷雾干燥时，需要一定温度，在喷雾塔里面进如一定温度热空气，对于那些对热不稳定酶蛋白不宜使用，现用在生产主要是生产α-淀粉酶。3.4膜分离技术除上述经典浓缩方法外，当前膜技术发展已应用到酶蛋白浓缩和分离上来了，膜分离技术是以一定孔径高分子膜作为过滤介质，将不一样大小、不一样性状、物质颗粒或大分子进行分离技术。膜分离技术所使用膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢、尼龙等高分子聚合物制成高分子膜。在膜分离过程中，膜作用是有选择性地小于其孔径颗粒经过，将大颗粒截留，依据欲分离物质颗粒大小，选择不一样孔径膜。

依据物质颗粒经过膜原理及和推进力不一样，膜分离技术可分为以下三种：①加压膜分离加压膜分离是以膜两侧流体静压差为动力，推进小于膜孔径颗粒经过膜孔，大于孔径颗粒被截留。依据膜孔径大小范围又分为超滤、微滤和反渗透三种。

超滤：即超出滤，本技术过滤截留颗粒直径在20—A（0.2μm)相当于分子量1000—5×105Da,而且有各种规格供选取。此法主要用于酶蛋白浓缩和个别纯化分离，另外，在生化药业也常被采取。此技术采取滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成高分子膜，膜由两层组成，分表层和基层，表层是滤膜有效层，其厚度为0.1—5μmμm，孔径大小有各种规格，现有20—A系列产品销售；基层为支持层，主要负责膜强度，其厚度为200—250μm含有坚韧强度。影响超滤原因：膜过滤效果用膜流率来表示，即每平方厘米膜每分钟滤过流体量，以ml./cm2.min表示，影响流率主要原因有膜孔径大小、颗粒性状、溶液黏度、流体静压。依据上述影响原因，可在一定范围内增加流体静压（普通控制在50—700kPa)、适当提升溶液温度、增加溶液搅拌述度都可在一定程度上提升膜流率。超滤技术在当前不论是试验室研究还是酶制剂工业化生产应用都非常广泛，其操作简单，工作效率高，但对于那些有小分子辅酶酶制剂不宜采取此技术。

微滤：又称微孔过滤，其孔径较超滤膜孔径大，普通在0.2—2.0μm范围，主要用于过滤去除细菌及其它显微镜下可见颗粒物质，此法在酶蛋白浓缩和分离方面不用，主要勇于矿泉水、无菌水、软饮料生产方面除菌和除去不溶性颗粒物质。

反渗透：反渗透膜孔径最小，普通在20A，截留分子量为1000D主要用于分离各种离子和小分子物质，此技术主要用于生产纯水，海水淡化等。

②电场膜分离：将膜分离装置置于电场下，被分离物质在电场作用下，借助电场力作为推进力，以到达分离目标。利用电场膜分离物质，必须具备一个基础条件，那就是其必须是带电粒子，假如其不带电荷，或其静电荷为零，这么粒子就不宜用此法分离。常见有以下两种方法：

电渗析：在一个电渗槽内，用两块半通透膜隔成三个室，中间室装待分离液，两侧室装水或缓冲液，并装有电极，接通电源后，带正电荷粒子向负极渗透，而带负电荷粒子向正极渗透，从而到达分离目标。此法多用于酶液脱盐，去除杂质等。

离子交换膜电渗析：其装置与电荷风析一致，只是所用膜较为特殊，两块膜上带有带电基团，且电性相反，使得带相同电荷粒子不能靠近膜，不致于影响膜通透性。其应用范围与电渗析一致，当溶液浓度较高时，此法工作效率更高。③扩散膜分离：扩散膜分离主要是指透析方法，将酶溶液装在由扩散膜制成透析袋中，再将透析袋置于扩散介质（缓冲液）中，溶液中小分子就经过膜扩散出来，大分子被截留在袋内。此法主要用于没蛋白脱盐；另外此法还可用于酶蛋白浓缩，当浓缩酶蛋白时，是用高浓度吸水性较强扩散介质，常见有甘油、聚乙二醇（粉剂）等。酶工程酶制剂制备第10页CH4-2酶蛋白提纯与精制

普通情况下，工业上用大多是经过初步提纯和浓缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；另外对于开发出新酶制剂，在投入规模化生产前，为研究其各种酶蛋白特征和酶学特征，也需要将酶深入提纯和精制。

酶蛋白提纯经典程序包含：离子交换层析——分子筛过滤层析——电泳检测纯度（必要时可进行制备电泳分离）酶工程酶制剂制备第11页各类层析原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析

分子筛效应排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析

分离物与配体之间有带配基sepharose

特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有各种电荷基团配体相偶联

sepharose6B）酶工程酶制剂制备第12页CH4-2酶蛋白提纯与精制

1离子交换层析法

（1）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上一些极性基团，经过极性基团静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上活性基团性质不一样，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。阴离子交换剂：

当离子交换剂携带阳性基团，用来吸附阴离子时，交换剂称为阴离子交换剂。

当前常见阴离子交换剂有：

DEAE～纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）

DEAE～纤维素适宜用来分离分子量在10,000-100,000或以上蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱床体积基础保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附0.1—1.1毫克酶蛋白。

DEAE～SephadexA50

DEAE～SephadexA50交换容量更大，（5.0毫克/克交换剂），但其有一最大不足，就是在洗脱过程中，伴随离子强度增加柱床体积变小，影响分离效果。

AE～纤维素（氨基乙基纤维素）阳离子交换剂：

阳离子交换剂有：

CM～纤维素（CM－C，羧甲基纤维素）。弱酸性阳离子交换剂。磷酸纤维素（P－C）

中酸性离子交换剂。酶工程酶制剂制备第13页常见阳离子交换剂

离子交换剂可电离基团可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基酶工程酶制剂制备第14页常见阴离子交换剂

AE-纤维素（弱碱型）氨基乙基离子交换剂可电离基团可电离基团结构PAB-纤维素（弱碱型）对氨基苯甲酸DEAE-纤维素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强碱型）三乙基氨基乙基QAE-纤维素（强碱型）二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基（中弱碱型）（中弱碱型）酶工程酶制剂制备第15页CH4-2酶蛋白提纯与精制

1离子交换层析法（2）离子交换分离酶蛋白基础原理：

普通情况下，酶蛋白等电点在pH7以下，所以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；（有些酶蛋白等

电点较高，能够将其置于偏酸性溶液中，这么酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应选取阳离子交换剂）。在同一pH条件下，因为不一样蛋白质所带电荷不一样，其与交换剂亲和力不一样，经过梯度增加洗脱剂离子强度，按蛋白质与交换剂亲和力由小到大，依次被洗脱下来，到达分离目标。酶工程酶制剂制备第16页离子交换层析原理示意图

蛋白质浓度洗脱体积带正电荷蛋白质带负电荷蛋白质搜集样品管搜集样品管带负电荷蛋白质蛋白质混合物玻璃柱带正电荷蛋白质带负电荷蛋白质带正电荷蛋白质搜集样品管NaClNaCl梯度酶工程酶制剂制备第17页CH4-2酶蛋白提纯与精制

1离子交换层析法

离子交换拄层析基础程序及关键点：（以DEAE～纤维素为例）

①离子交换剂处理：首先将DEAE～纤维素用蒸馏水浸泡溶涨，然后按：0.5N盐酸处理30分钟以上（不停搅拌）→蒸馏水重复洗涤致中性→0.5N氢氧化钠处理30分钟（不停搅拌）→蒸馏水洗涤致中性。

②洗脱液pH确实定：采取pH梯度测定。按10％交换当量加入离子交换剂和酶蛋白振荡保温20－30min静止后，测定上清夜酶活力到没有酶活力测出试管pH＋1，即为离子交换洗脱液最适pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7④平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于洗脱流述，使流出缓冲液pH与流入相同。⑤上样和平衡：为到达良好分离效果，上样量普通为其交换容量10—20%，样品pH值和离子强度应与洗脱液一致。上样后用洗脱Buffer平衡。洗脱曲线：⑦分部搜集：利用自动分部搜集器搜集。⑥洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗脱下那些与交换剂结协力很小或不结合杂蛋白；然后，经过改变洗脱液离子强度进行梯度洗脱梯度洗脱公式为：

Ｃ=C2－(C2－C1)(1－v/V)A2/A1C2：洗脱液极限离子浓度；C1：初始离子浓度；

v：洗脱液流出体积；V：贮液室和混合室总体积；A2：贮液室截面积；A1：混合室截面积；

当A2/A1等于1时，上述公式代表一个直线梯度改变；当小于1时，为凹形梯度改变；当大于1时，为凸形梯度改变。

③装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用倾倒法装柱。(8)搜集与浓缩凝胶颗粒蛋白质混合物大分子小分子储液瓶混合瓶层析柱磁力搅拌器洗脱剂体积（mL）洗脱剂浓度简单型梯度混合器梯度洗脱曲线洗脱剂体积（mL）洗脱剂浓度储液瓶混合瓶复合型梯度混合器梯度洗脱曲线凸形线形凹形酶工程酶制剂制备第18页CH4-2酶蛋白提纯与精制

2分子筛层析法（1）分子筛层析法基础原理

凝胶过滤法是以不一样蛋白质分子量大小差异来将不一样蛋白质分开方法。最常见凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2环氧化丙烷（交联剂）相互交联而成中央带有微孔球状凝胶颗粒，依据凝胶分子交联程度不一样，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8种型号，G50以下为硬胶，G75以上为软胶。G10交联度最高，分子内网孔最小；G200交联度最低，分子内网孔最大。依据蛋白质分子大小不一样，在经过层析柱时，走旅程不一样，从而分开。

（2）凝胶选择：

G25以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量在5000以下小肽。

G50主要用于分离分子量1500—30000小分子蛋白。

G753000—80000G1004000—150000G1505000—300000G2005000—600000（3）凝胶溶胀：

凝胶规格融胀体积（ml/g)时间/h.20C时间/h.90-100CG102－331G152.5-3.531G254-631G509-1131G7512-15243G10015-20723G15020-30725G20030-40725

(4)装柱：装柱前必须进行凝胶脱气处理，装柱要求同离子交换层析

（5）装柱效果检测：

用带有颜色大分子上样，然后洗脱，检测样品走柱介面效果，常见蓝色葡聚糖－。

（6）上样：

和离子交换层析有根本不一样。主要考虑上样体积，普通控制在1％－10％。视详细情况而定。

（7）洗脱

洗脱剂能够用低浓度Buffer，也可用蒸馏水；在洗脱过程中，主要控制两个参数：流速和有效操作压凝胶规格流速（ml/h.cm2)有效操作压(cm/H2O)G10G15G25G50G7577160G1005096G1502336G2001216（8）分部搜集：

基础同离子交换层析(9)凝胶再生与保留：再生：用0.1mol盐酸和0.1mol氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性，重新装柱，可重复使用；保留：用0.1mol盐酸和0.1mol氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性；50％乙醇——75％乙醇——95乙醇——冰箱保留。酶工程酶制剂制备第19页蛋白质Mr=49,000洗出液中蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量关系

Andrews经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”

G-200G-100logMrKav酶工程酶制剂制备第20页吸附层析

（absorptionchromatography）

原理：载体：硅胶氧化铝羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当溶剂作流动相。因为各种物质极性不一样，被吸附剂吸附程度和在流动相中溶解度不一样。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不一样程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不一样速度随流动相向前移动。酶工程酶制剂制备第21页分配层析

（distribuptionchromatography）

原理：载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质分离判定

分配层析实际上是一个连续抽提方式。如纸层析中滤纸结合水为固定相，以水饱和有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中溶质在水和有机相中溶解度不一样而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自分配系数进行不停分配，从而使物质得到分离和纯化。酶工程酶制剂制备第22页逆流分溶原理示意图物质Y(Kd=1)分配情况溶剂A物质Z(Kd=3)分配情况溶剂B总量总量总量总量总量总量平衡后转移1转移2转移3分溶管号转移4上相转移下相转移上相转移管中蛋白质总量物质Y物质Z分溶曲线管号有效分配系数（Keff）

某一物质在A相中总量某一物质在B相中总量酶工程酶制剂制备第23页亲和层析（affiuitychromatography）

应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶结构与功效+待纯化分子配体a.理论依据：待纯化分子和配体间含有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯待纯化分子原理：基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、

sepharose、sephadex酶工程酶制剂制备第24页亲和层析原理示意图

蛋白质混合物配体与配体结合蛋白质加入可溶性配基专一性结合蛋白质没有结合蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质酶工程酶制剂制备第25页聚焦层析（Chromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来，其分离纯化蛋白质依据是等电点差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列过程叫做聚焦效应。pH梯度形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应先决条件，假如一个蛋白质加到已形成pH梯度层析柱上时,因为洗脱液连续流动，蛋白质将快速地迁移到与它等电点相同pH处。从此位置开始，该蛋白质将以迟缓速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一个样品分次加入时，只要先加入者还未洗出,而且有一定时间进行聚焦,剩下样品还能够加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率层析时聚焦效应示意图酶工程酶制剂制备第26页几个主要层析方法比较酶工程酶制剂制备第27页

酶蛋白经分离纯化后纯度怎样，必须用适当试验方法进行判定，最常见方法是‘聚丙烯酰胺凝胶电泳’（PolyacrylamideGelElectrophoresisPAGE）,现已发展成很多方法，如：PAGE圆盘电泳（柱状电泳）、PAGE垂直板状电泳等。

酶工程酶制剂制备第28页CH4-2酶蛋白提纯与精制

3酶蛋白纯度检测⑴电泳基础原理聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺单体（Acr)和N，N-亚甲基-双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，经聚合反应而形成，依据欲分离蛋白分子大小，经过控制Acr和Bis百分比以及总浓度来控制凝胶孔径大小，制成各种孔径凝胶，这么蛋白质颗粒在电泳时，两种作用力，即电场力和蛋白质颗粒在电场中运动所受阻力，

F=H.Q……………（1）

F/=6π．γην（2）F:电场力；

H：电场强度；Q：质点所带电荷；

F/：：质点所受阻力；γ：质点半径；η：电解质黏度；ν电泳述度；

酶工程酶制剂制备第29页在一定电场中，蛋白质分子理论电泳迁移述率（即迁移述度）

V=Q/6π．γ.η（3）

从这个公式中能够看出，V与蛋白质所带电荷多少成正比，而与蛋白质分子大小成反比。不一样蛋白质，其分子量和所带电荷多少都表现出不一样程度差异，从而在电泳时有不一样迁移输率，经电泳后，不一样蛋白分子迁移到电泳介质不一样部位，经过蛋白质染色处理，在凝胶不一样区域表现出对应电泳带。从这个原理来讲，电泳技术不但能对蛋白质进行纯度判定，而且还是分离提纯有效方法。酶工程酶制剂制备第30页电泳技术分类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电泳支持物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳酶工程酶制剂制备第31页聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在区带电泳原理基础上，以孔径大小不一样聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采取电泳基质不连续体系(即凝胶层不连续性、缓冲液离子成份不连续性、pH不连续性及电位梯度不连续性)或连续体系（一层凝胶、一个pH和一个缓冲溶液），进行电泳分离一个方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂作用下聚合而成，聚合反应催化系统有两种。化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED

光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED

不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应酶工程酶制剂制备第32页不连续PAGE浓缩效应

样品浓缩胶分离胶快离子慢离子蛋白质ABC++--样品浓缩胶分离胶电极缓冲液低电位梯度E11高电位梯度E21+-酶工程酶制剂制备第33页SDS

原理：

当SDS（SodiumDodecylSulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量负电荷，并远远超出了其原来电荷，从而使天然蛋白质分子间电荷差异就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得涣散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生泳动率差异，就反应了分子量差异。在此条件下，样品分子量对数与其在凝胶中迁移率呈直线关系。可用下式表示：

LogMr=a–bmr应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数Mr（相对迁移率）mr（相对迁移率）LogMr酶工程酶制剂制备第34页等电点聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一个多氨基多羧基混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电经过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等pH区域，从而使不一样化合物能按其各自等电点得到分离。应用：

高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线性梯度酶工程酶制剂制备第35页琼脂糖电泳

琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水L-半乳糖连接组成多糖链，这种多糖链在1000C左右时呈液态，当温度下降到450C以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环琼脂糖，经凝聚即呈束状琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶用作电泳固相支持物含有分子筛效应，其对生物分子分离作用不但与其分子构象及其相对分子质量大小相关，而且与凝胶浓度也有亲密关系，故可依据分离对象分子量大小选择适当浓度凝胶。

琼脂糖电泳常见于核酸分离，用各种浓度琼脂糖凝胶能够分离长度为2OObP至5OkbDNA，

琼脂糖凝胶还常见作免疫电泳固相支持物。酶工程酶制剂制备第36页不一样浓度琼脂糖凝胶分离DNA范围琼脂糖凝胶浓度／(%)可分辨线性DNA大小范围／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相对分子质量标准物水平型平板电泳槽

酶工程酶制剂制备第37页毛细管电泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（

2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品分离，分离后样品依次经过设在毛细管一端检测器检出。该法克服了传统区带电泳热扩散和样品扩散问题，实现了快速和高效分离。

毛细管电泳是多年来发展起来一项新技术，被认为是90年代最有影响分离伎俩之一。当前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物分析判定等。

毛细管电泳原理示意图酶工程酶制剂制备第38页毛细管电泳装置示意图30KV高压电源光源光电倍增管数据采集石英玻璃毛细管缓冲液-样品缓冲液正极负极酶工程酶制剂制备第39页CH4-2酶蛋白提纯与精制

3酶蛋白纯度检测

⑵基础操作关键点①聚丙烯酰胺凝胶浓度确定凝胶孔径由丙烯酰胺单体（Acr）和双体（Bis）总浓度（T%）和双体占总浓度百分比（C%）所决定。

T%＝（a＋b）/m×100%

C%＝b/（a＋b）×100%a：单体；b：双体；m:凝胶溶液体积T％：凝胶总浓度，主要考虑要分离蛋白质分子量大小而定；C％决定凝胶交联度高低；在T％确定后；调整C%，可改变凝胶孔径大小。经验公式是：C＝6.5－0.3T

还有些学者主张固定为C＝5％T

聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表

样品分子量范围适宜T%蛋白质<10420-30104－4×10415-20

4×104－10510-15105－5×1055-10

>5×1052

-5核酸<10415-20104－1055-10105－2×1062

–2.6②凝胶聚合化学聚合：用过硫酸铵（AP）作催化剂，用四甲基乙二胺（TEMED）作加速剂；用量：TEMED加总体积0.005倍

PA％加总体积0.05倍聚合时间普通在室温下30-60min光聚合：用核黄素作催化剂1mg/100ml③点样：注意样品密度和点样量；④电泳：恒压电泳和恒流电泳⑤取胶：⑥固定：7%醋酸或12.5％三氯醋酸⑦染色：染色液有氨基黑10B

考马斯亮兰G250考马斯亮兰R250

⑧蛋白质纯度确定：纯一谱带酶工程酶制剂制备第40页三、离心技术

1．离心机类别普通离心机

1000转/分高速离心机2-3万转/分超速离心机

3万转/分2．沉降系数（sedimentationcoefficient,s）3．超离心法类别

密度梯度离心法（densitygradient）

沉降速度法（sedimentationvelocity）

沉降平恒法（sedimentationeguilibrium）酶工程酶制剂制备第41页离心机结构示意图转头转头腔沉降样品驱动马达真空冷冻酶工程酶制剂制备第42页

沉降系数

（sedimentationcoefficient）

生物大分子在单位离心力场作用下沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场作用下，从静止状态抵达极限速度所需要时间。数学定义式为：

沉降系数单位：因为蛋白质、核酸、病毒等沉降系数介于1×10-13介于10-13到200×10-13s范围，为方便起见，把1×10-13s作为沉降系数一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。沉降系数（s）与相对分子量（Mr）关系:Mr=RTsD(1-

)Svedberg方程:d/dt

2

s=酶工程酶制剂制备第43页密度梯度离心法（densitygradient）

生物大分子及颗粒沉降不但决定于它大小，而且也取决于它密度。颗粒在含有密度梯度介质中离心时，质量和密度大颗粒沉降快，而且每种蛋白质颗粒沉降到与本身密度相等介质密度梯度时，即停顿不前，最终各自在离心管中被分离成独立区带。分成区带样品能够在管底刺一个小孔逐滴放出，分步搜集。常见介质有蔗糖、氯化铯等。滴加样品离心管蔗糖密度梯度蔗糖浓度酶工程酶制剂制备第44页1、核酸密度测定=o+4.2

2(2-02)10-102、测定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸构象研究：单链DNA双链DNA蛋白质双链DNARNA4、核酸制备

氯化铯密度梯度超离心经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒DNA及各种杂质分布超螺旋DNA闭环质粒DNA开环质及线型DNA蛋白质石蜡油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中应用酶工程酶制剂制备第45页沉降速率法（sedimentationvelocity）

在离心场作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向（径向）移动，并产生沉降界面，界面移动速度代表蛋白质沉降速度。在界面处因为浓度差造成折射率不一样，可借助适当光学系统，如schlieren光学系统（也称暗线光学摄影系统），观察到这种界面移动。在schlieren光学系统中，利用溶液折射率梯度（d

/d

）和样品浓度梯度（dc/d

）成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动界面以峰形曲线展现在摄影图片上，峰顶代表移动界面。离心机装置允许在离心机转头旋转时，对界面移动进行观察和拍照。酶工程酶制剂制备第46页分析型超速离心机光源柔性驱动轴热敏温度计样品池准直透镜液面沉降界面溶剂配衡池沉降界面聚光透镜马达滤光片溶质空气沉降方向摄影机透镜园柱型透镜底板Schlieren光闸真空冷冻12c

d

/d

酶工程酶制剂制备第47页沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）

在较低速度（8,000-20,000r/min）离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，因为沉降结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高恒定浓度梯度。假如测得相关参数即可算出生物分子分子量。离心力x1轴心液面离心轴扩散力x2Mr=(1-)2(

22-

12)2RTdln(c2-c1)计算公式以下：酶工程酶制剂制备第48页CH4-3酶制剂成型与保留

1酶制剂主要剂型及其制备⑴酶制剂主要剂型：