dna的重组和基因工程

dna的重组和基因工程dna的重组和基因工程第1页

Chapter35DNA重组与基因工程一、DNA重组分类同源重组、特异位点重组和转座重组等类型二、自然界基因转移和重组

自然界基因转移和重组是无目标基因工程有目标基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不一样物种间进行交换,并能在新位置上复制,转录和翻译。dna的重组和基因工程第2页

Chapter35DNA重组与基因工程二、自然界基因转移和重组1、结合作用结合作用——质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）2、转化及转导作用（1）转化作用transformation

经过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养受体细胞取得新遗传表型过程（2）转导作用transduction

病毒、噬菌体介导溶菌路径溶原菌路径3、转座dna的重组和基因工程第3页（2）转导作用transduction

病毒、噬菌体介导溶菌路径溶原菌路径2、转化及转导作用dna的重组和基因工程第4页3、转座转座

反向重复序列由可移动DNA序列（插入序列和转座子）介导基因移位或重排①插入序列转座保守性转座复制性转座反向重复序列转座酶②转座子转座转座子—能够从一个染色体位点转移至另一位点分散重复序列dna的重组和基因工程第5页

Chapter35DNA重组与基因工程二、自然界基因转移和重组4、基因重组不一样DNA分子间发生共价连接称重组（一）位点特异重组特异位点（二）同源重组同源序列间重组dna的重组和基因工程第6页

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术1973Cohen第一例成功克隆试验1978Genentech企业人胰岛素世界上第一个基因工程蛋白药品

1982

第一个基因工程药品--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985

第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

dna的重组和基因工程第7页1993

基因工程西红柿在美国上市1997

英国罗斯林研究所多莉羊1999.9

中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列1%.6.26科学家公布人类基因组工作草图.2.11

公布人类基因组基础信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术dna的重组和基因工程第8页胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体dna的重组和基因工程第9页

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术（一）重组DNA技术相关概念1、DNA克隆克隆（clone）无性繁殖分子克隆(DNA克隆)—应用酶学方法，在体外将目标基因与载体DNA结合成一含有自我复制能力DNA分子（复制子、重组体），继而经过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增、提取取得大量同一DNA分子拷贝，或其表示产物。基因克隆、DNA重组、基因工程(geneticengineering)dna的重组和基因工程第10页基因克隆示意图dna的重组和基因工程第11页

2、工具酶常见工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标识、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标识末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（一）重组DNA技术相关概念dna的重组和基因工程第12页限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系

限制性核酸内切酶甲基化酶识别特异位点—酶切位点回文结构4～6bp出现两种末端粘性末端粘端

平头末端平端

配伍末端（一）重组DNA技术相关概念dna的重组和基因工程第13页目标基因（外源基因）cDNA逆转录基因组DNA基因工程目标目标基因拷贝克隆载体基因表示产物表示载体3、目标基因targetDNA（一）重组DNA技术相关概念dna的重组和基因工程第14页

自我复制克隆载体、表示载体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）真核载体：动物病毒载体pLXSN质粒—存在于细菌染色体外小型环状双链DNA分子理想质粒

1.拷贝数多;2.两三个抗药性基因terrampr

筛选标志3.适当限制性内切酶酶切位点（单一）（一）重组DNA技术相关概念4、基因载体vectordna的重组和基因工程第15页dna的重组和基因工程第16页

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术基础原理（一）目标基因取得1、化学合成法2、基因组DNA基因组DNA文库—存在于转化细菌中、克隆载体携带全部基因组DNA集合3、cDNA

cDNA文库4、聚合酶链式反应PCRdna的重组和基因工程第17页(二)克隆载体选择和构建(三)外源基因与载体连接（DNA连接酶）连接方式

1.粘性末端连接连接效率高相同酶切末端配伍末端

2.平端连接连接效率低

3.同聚物接尾法

4.人工接头法

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术基础原理dna的重组和基因工程第18页重组DNA技术简图dna的重组和基因工程第19页(四)重组DNA导入受体菌基因工程菌

HB101,JM109转化制备感受态细胞冷氯化钙处理细胞处于最适摄取和容忍外来DNA生理状态

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术基础原理dna的重组和基因工程第20页(五)重组体筛选screening/selection1.直接选择法

抗药性标志选择

标志补救表示产物与营养缺点互补

α—互补蓝白斑筛选

分子杂交探针原位杂交/Southern印迹法

限制性酶切图谱/PCR2.非直接选择法免疫学方法

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术基础原理dna的重组和基因工程第21页(六)克隆基因表示载体有转录、翻译元件密码子通用1、原核表示体系

原核表示载体标准适当筛选标志强开启子翻译控制序列多克隆位点

Chapter35DNA重组与基因工程三、重组DNA技术基础原理dna的重组和基因工程第22页

Chapter35DNA重组与基因工程四、重组DNA技术与医学关系

分子医学molecularmedicine（一）疾病基因发觉（二）发展生物制药基因工程药品基因工程疫苗（三）DNA诊疗基因诊疗

基因诊疗—用分子生物学技术对引发疾病原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及一些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因检测和分析.DNA/RNAdna的重组和基因工程第23页

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