盐酸雷嗪遗传毒性及安全性评价

盐酸雷嗪遗传毒性及安全性评价

诺亚是美国先前开发和开发的脂肪酸氧化抑制剂（pfox）。其作用方式不同于传统的抗凝剂，它不仅可以降低心率和血压，还可以直接减少心脏，优化心肌能量的代谢。1材料和方法1.1材料表面1.1.1仪器和设备LRH-150生化培养箱(上海-恒科技有限公司),TGL-16型离心机(上海医疗器械厂),HZ-9211K恒温振荡器(华利达实验设备厂),DW-HL218超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司),普通冰箱(海尔集团有限公司),JHT-DS超净工作台(济南康宝设备净化有限公司),BS224S赛多利斯电子分析天平(精密度0.0001g),显微镜(北京冠普佳科技有限公司),HH-S21-2型恒温水浴箱(山东医疗器械厂),PHS-25C数显酸度计(上海宇隆仪器有限公司),IKAT10basic匀浆机(德国IKA公司),YXQG02型高压灭菌锅(山东新华医疗有限公司)。1.1.2齐鲁经营盐酸雷诺嗪(含量99.96%,批号0502001),由齐鲁制药厂提供。环磷酰胺(CP,上海华联制药有限公司,批号050304),叠氮钠(NaN1.1.3实验动物及仪器清洁级KM小鼠114只,雌性32只,雄性82只,体质量25～30g,由山东大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(鲁)20030004。1.1.4鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株的筛选小牛血清(上海普飞生物有限公司),吉姆萨染液(北京化学试剂公司),PBS(pH6.8),1640细胞培养基(Gibco),甲醇(AR,北京化学试剂公司),伊红(AR,北京化学试剂公司),结晶紫(AR,沈阳试剂三厂),四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97、TA98、TA100和TA102由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所提供。按照试验要求,对试验用的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株进行了组氨酸需求试验、结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验、紫外线敏感试验、自发回变试验、阳性对照试验。结果显示,各菌株的特性正常,自发回复突变菌落数均在正常范围内,阳性对照的回复突变菌落数高于相应菌株自发回复突变菌落数2倍以上。1.2方法1.2.1g/样品时抑菌反应正式试验前进行预试验,观察盐酸雷诺嗪对试验菌株的毒性,根据预试结果确定本试验剂量范围。当盐酸雷诺嗪剂量达5000μg/皿时,试验菌株未出现抑菌现象。故选用5000、2500、1000、500、250、125μg/皿6个剂量进行正式试验。同时设自发回变对照、溶剂对照和阳性突变剂对照,在加入与不加入S9条件下进行试验。37℃培养48h后计数每皿回变菌落数,如果受试物回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上,并有剂量-反应关系,则为阳性结果,试验重复1次。1.2.2各组大鼠血清中盐酸雷嗪含量的比较预试验:随机选取KM小鼠14只,雌雄各半,选取4只(雌雄各半)灌胃给予1/2LD正式试验:选取体质量25～30g清洁级KM小鼠50只,雌雄各半,按照空腹体重随机分为5组,分别为盐酸雷诺嗪低剂量组(55μg/g)、中剂量组(111μg/g)、高剂量组(222μg/g)、阳性药物组(CP组,40μg/g)和生理盐水组(Veh组),每组10只。灌胃给药体积均为20μL/g,间隔24h两次给药,药后微核发生的敏感期30h将动物颈椎脱臼处死,取股骨按常规制片,姬姆萨染色,在光学显微镜下,以每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE),微核发生率以含微核的PCE千分率计,计数200个嗜多染红细胞,并计算嗜多染红细胞与正成红细胞的比例(PCE/NCE)。1.2.3小鼠附睾丸的制备选取50只KM雄性小鼠(体质量25～30g),按照空腹体质量随机分成5组,盐酸雷诺嗪低剂量组(55μg/g)、中剂量组(111μg/g)及高剂量组(222μg/g),另设生理盐水组(Veh组)和阳性对照组(CP组,40μg/g),每组10只。受试物按20μL/g灌胃,连续灌胃5d,继之饲养30d,自由摄食、饮水,于第35天颈椎脱臼处死,每组随机选5只小鼠分别取两侧附睾,置于放有2mL生理盐水的平皿中,用眼科剪将附睾纵向剪1～2刀,静置3～5min,轻轻摇动,用4层擦镜纸过滤,吸滤液涂片,干燥后甲醇固定5min,2%伊红染色1h,用水轻冲、干燥。高倍镜下检查每只动物的精子形态,计数1000个结构完整的精子,记录畸形精子数,计算畸变精子发生率。如试验组与对照组的精子畸形率有剂量-反应关系且有统计学意义时,则为阳性结果,否则为阴性。1.3统计处理采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理,计量资料用2结果2.1盐酸雷嗪对鼠伤寒沙门氏回复突变型菌株的致突变性两次试验表明,Veh组及盐酸雷诺嗪在≤5000μg/皿所测剂量范围内,回变菌落数均在自发回变数的2倍以下,在加入和不加入S9时,盐酸雷诺嗪各剂量组对鼠伤寒沙门氏突变型四个菌株均未呈现出致突变性,而阳性对照组回变菌落数均为自发回变组菌落数的2倍以上。结果见表1,表2。2.2大鼠骨髓疾病红细胞的微标签与Veh组相比,盐酸雷诺嗪在所测剂量范围内微核数无统计学差异(3.3大鼠截面畸形试验的结果经3ames试验和小鼠精子畸形试验结果分析雷诺嗪作为一种新型代谢调节剂和选择性抗心绞痛药物,作用机理独特,可部分抑制脂肪酸氧化,不影响心率、血压和心脏的泵功能。对充血性心力衰竭的心绞痛患者有效,而对慢性心绞痛患者耐受。临床上既可单独使用,也可与其它抗心绞痛药物联合应用,为临床有效治疗心绞痛、心力衰竭和其它心血管疾病提供了新的思路雷诺嗪于2006年1月获FDA批准,500mg薄膜包衣缓释片(Ranexa)现在国外已上市。山东齐鲁制药有限公司率先对该产品进行开发。本研究参照我国新药审批技术指导原则,对盐酸雷诺嗪(雷诺嗪的注射剂型)的遗传毒性在基因水平和细胞水平方面进行安全性评价。根据我国新药审批技术指导原则推荐的遗传毒性检测试验组合,本研究选取了Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验。Ames试验是目前检测基因突变最常用的方法之一,检测原理是检测受试物诱发鼠伤寒沙门菌组氨酸营养缺陷型菌株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力,许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成。大鼠肝S9是许多体外常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化酶系统,不加S9混合液得到阳性结果,说明受试物是直接诱变剂,加S9混合液得到阳性结果,说明受试物是经S9活化后产生致突变性;微核是常用的遗传毒理学指标之一,表示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧,而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比,因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度,它不仅能很好地检测化学突变剂对细胞遗传物质的损伤性,还能测出某些较低浓度的化学物质诱导的反应;小鼠精子形态受基因控制,精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此,形态改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变本研究Ames试验检测结果表明,盐酸雷诺嗪在≤5000μg/皿剂量范围内,对鼠伤寒沙门氏突变型四个菌株(TA97、TA98、TA100和TA102)均没有直接回复突变能力;与大鼠肝S9共孵育后,得到同样的结果,表明盐酸雷诺嗪不引起沙门氏菌的碱基置换或移码突变,因此不具有直接或间接的遗传物质损伤潜能;在微核试验中,在所测剂量范围