欧李与其他核果类愈伤组织结构及其嫁接亲和性探讨

欧李（Cerasushumilis）为蔷薇科樱属灌木，原产于我国，网状根系发达，抗旱耐瘠薄能力极强，果实中钙、铁含量较高，有“钙果”之称[1]。肖啸等[2]以毛桃、山桃、毛樱桃、山杏为砧木嫁接欧李，结果显示欧李与毛樱桃、毛桃嫁接成活率较高，山桃次之，山杏最低。温福欣[3]将‘京欧1’欧李嫁接在毛桃、山樱、麦李、毛樱桃4种砧木上，结果表明毛桃为‘京欧1’的最适砧木。周建忠等[4]选育了适宜欧李嫁接的乔化砧绣川小叶李及其适宜的接穗欧李品系。丁杰等[5]以欧李、毛桃为砧木嫁接桃品种瑞蟠4号，比较了瑞蟠4号+欧李和瑞蟠4号+毛桃叶片的厚度、栅栏组织和海绵组织等16个与抗旱相关的解剖结构特征参数，认为欧李砧能提高桃的抗旱能力。耿杰[6]对比了2017年和2018年瑞蟠4号+欧李、瑞蟠4号+毛桃、春美+欧李、春美+毛桃4种嫁接组合的树势，结果显示树体高度降低，枝条长度减小，发枝量减少,欧李砧木嫁接桃使嫁接植株明显矮化。以上研究均表明欧李和核果类果树均有一定的嫁接亲和性，但亲和力有一定的差异，应进一步分析产生差异的原因。传统的鉴定亲和力的方法是在田间进行砧穗嫁接，但该方法耗时较多，占空间较大。在理论上，有多种方法可对嫁接亲和力进行早期鉴定，如解剖结构上可对砧穗解剖结构的相似度或嫁接体愈合情况进行鉴定，分子生物学上可对愈合过程中差异表达蛋白进行鉴定，生理生化方面可对嫁接体根系活力、生物酶活性、物质代谢情况等进行鉴定。通过微嫁接进行亲和力鉴定，操作方便、周期短、占用空间少、见效快[7]，但多数利用组培苗进行嫁接，少用愈伤组织嫁接。愈伤组织嫁接既可探讨砧穗嫁接亲和力，同时又可完成砧穗愈伤组织形态及解剖结构的观察比对，省时省工。本研究以欧李叶片及其他4种核果类果树叶片为外植体诱导愈伤组织，对愈伤组织细胞进行细胞形态及解剖学分析后，再进一步进行愈伤组织嫁接的尝试，为果树嫁接亲和性探讨提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料以河南科技大学校园内生长的欧李、毛桃、杏（ArmeniacavulgarisLam.var.vulgaris）、欧洲甜樱桃、梅（ArmeniacamumeSieb.var.mume）等植物的幼嫩叶片为试验材料。1.2试验方法1.2.1愈伤组织的诱导。以欧李、毛桃、杏、梅、欧洲甜樱桃的幼嫩叶片作为外植体，按常规方法消毒处理后分别接种到MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+0.7%琼脂培养基中。在24h光照、光照强度为500～1000Lx、温度为22～25℃的条件下培养。培养30d后，取颜色鲜黄、状态良好的初生愈伤组织接种到新鲜的培养基上,以后每20d继代1次，使每组愈伤组织数量不少于30瓶。1.2.2愈伤组织的形态观察。最后1次继代2周后，观察愈伤组织形态、质地、颜色及生长状况，并记录描述结果。1.2.3愈伤组织的解剖结构观察。每种材料选取生长状况良好的愈伤组织，切成绿豆粒大小，采用传统石蜡切片法制片，在徕卡显微镜下用40倍镜观察，每个切片观察3个视野，统计每个视野的细胞密度，并对细胞的长轴和短轴进行测量，每组测定细胞个数不少于100个。最后将数据录入Excel进行统计和分析。1.2.4愈伤组织的嫁接与观察。将嫁接夹及解剖刀等工具在121℃高压灭菌锅灭菌30min，在无菌工作台进行嫁接。嫁接时，先选取长势较好的欧李愈伤组织和杏等的愈伤组织放在超净工作台上，用已灭菌的刀将其切出1个平面，然后将2个平面对接，用嫁接夹夹住，接种到新鲜培养基上培养。每组嫁接愈伤组织不少于10瓶，并在24h光照、光照强度为500～1000Lx、温度为22～25℃的条件下培养。嫁接后观察并记录其污染和生长情况，培养15d后取出，将愈伤组织横切，观察其嫁接面的生长情况。2结果与分析2.1不同种愈伤组织色泽和质地及生长状况不同种核果类果树叶片愈伤组织的色泽和质地存在较大的差异。从色泽上看，欧李、欧洲甜樱桃的愈伤组织呈绿色；杏愈伤组织大部分呈淡黄色，部分呈黄褐色；梅愈伤组织部分呈淡黄色，部分呈黄褐色；毛桃的愈伤组织呈黄绿色，部分呈透明状（图1）。从质地上看，愈伤组织分为松散型愈伤组织和致密型愈伤组织。其中欧李和欧洲甜樱桃的愈伤组织全为致密型愈伤组织；杏全为松散型愈伤组织；梅有75%为致密型愈伤组织，25%为松散型愈伤组织；毛桃有60%为致密型愈伤组织，40%为松散型愈伤组织（图2）。图15种核果类果树叶片愈伤组织图2不同愈伤组织的质地总占比从生长状况上看，继代培养15d后，欧李和欧洲甜樱桃、杏愈伤组织由原本黄豆大小迅速长大，且分裂状态旺盛。而梅的愈伤组织生长较慢并逐渐变为深褐色（如图3a）。毛桃愈伤组织表现情况较复杂，前期生长较慢且部分变黑，进一步培养后在变黑组织周边长出新的愈伤组织并逐渐变绿（如图3b）。图3生长状况较差的愈伤组织2.2不同种愈伤组织的细胞密度由图4、图5可知，不同材料愈伤组织中细胞的密度差异较大，其中欧李愈伤组织的细胞密度最大，为214个细胞/视野；毛桃切片平均每视野的细胞密度最小，为110个细胞/视野。杏切片平均每视野的细胞个数与毛桃相差不大，欧李平均每视野的细胞个数约为杏、毛桃平均每视野细胞个数的2倍。图45种愈伤组织形态结构（40倍显微镜下愈伤组织切片视野）图5不同种愈伤组织切片平均每视野细胞个数2.3不同种愈伤组织的细胞大小由图6可以看出，愈伤组织细胞的平均直径差异显著。欧李叶片愈伤组织平均直径为16.66μm；毛桃平均直径为17.61μm；梅的平均直径为19.29μm；杏的平均直径为21.69μm；欧洲甜樱桃的平均直径为23.99μm。欧李与梅、欧李与毛桃愈伤组织的细胞平均直径差异不显著，欧李与欧洲甜樱桃、杏愈伤组织细胞的平均直径差异显著。图6不同种愈伤组织的平均直径由图7可以看出，欧洲甜樱桃愈伤组织细胞的平均面积最大，为487.42μm2，杏愈伤组织细胞的平均面积为424.04μm2，梅的平均面积为289.55μm2，欧李的平均面积为274.24μm2，毛桃的平均面积为274.12μm2。其中欧李与梅、毛桃愈伤组织的平均细胞面积无显著差异，但显著小于欧洲甜樱桃、杏愈伤组织细胞的平均面积。图7不同种愈伤组织的平均面积2.4嫁接后愈伤组织接口愈合情况由表1可知，嫁接后愈伤组织都有不同程度的污染，其中杏+欧李组合的污染率达到了80%，欧洲甜樱桃+欧李与梅+欧李2个组合均达到50%，这说明在嫁接操作过程中易造成污染，严格无菌操作规范可降低污染率。表1愈伤组织嫁接后存活情况在存活的嫁接组合中，欧李+毛桃的愈伤组织嫁接后生长良好，而且二者的颜色和质地比较相似，大部分接口间有明显的界限，但取下嫁接夹后二者并不分开；少部分接口处缝隙较大，松开嫁接夹后2块愈伤组织分开。欧李+欧洲甜樱桃的愈伤组织嫁接后的生长状况与欧李+毛桃的愈伤组织嫁接后的生长状况相似，一部分愈伤组织能长到一起，一部分愈伤组织不能长到一起。欧李与杏的愈伤组织嫁接后结合不紧密，但仍有部分愈伤组织的细胞交融到一起。欧李和梅的愈伤组织不能长在一起。上述事实说明欧李的愈伤组织与毛桃、欧洲甜樱桃、杏的愈伤组织嫁接后均有紧密接合的嫁接体，但由于受污染率较高的影响，结合体的比例均不高，部分嫁接愈伤组织之间存在裂缝，这可能与嫁接夹力度不够有关，也可能与嫁接亲和性不高有关，还需进一步试验。3结论与讨论3.1结论欧李与欧洲甜樱桃、毛桃、梅、杏愈伤组织的颜色、质地、细胞大小及生长速度均有差异，但愈伤组织的生长速度可能是影响愈伤组织嫁接亲和性的主要因素。3.2讨论愈伤组织嫁接是将获取的砧穗愈伤组织进行共培养，保持二者紧密接触，如二者愈伤组织融合则说明砧穗亲和，反之不亲和[8]。胡梦钰等[9]以‘富有’‘次郎’的愈伤组织嫁接小果甜柿、牛眼柿和君迁子的愈伤组织，结果显示已知不亲和的组合‘富有’+君迁子嫁接体产生深褐色物质，而其余嫁接体发育较好，嫁接口细胞排列整齐度较好。陈莉[10]以甜柿‘阳丰’为接穗，将其愈伤组织分别与‘阳丰’、君迁子、牛眼柿、小果甜柿4种砧木愈伤组织嫁接，结果显示小果甜柿和牛眼柿作为‘阳丰’的砧木时，嫁接后嫁接口表面无细胞褐化，结合部位有较多愈伤组织团形成，接穗长势和嫁接口发育情况基本与田间嫁接和试管苗嫁接结果一致。这说明愈伤组织的嫁接亲和性与砧穗组合的嫁接亲和性一致，可以用愈伤组织嫁接的结果预测田间砧穗组合嫁接结果。本试验观察了不同核果类果树愈伤组织形态与细胞形态，将不同愈伤组织进行嫁接，结果显示，不同愈伤组织间在质地、颜色、细胞密度、细胞大小等指标上有不同程度的