天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座

第一节提取方法与技术

天然药品化学研究是从有效成份或生理活性化合物提取、分离工作开始。在进行提取之前，应对所用药材进行以下考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文件，以充分了解和利用前人经验。（同一品种其含成份含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不一样而有改变）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第1页已知成份或已知化学结构类型：普通先查阅相关资料,（工业生产中惯用）搜集比较各种提取方法为制订研究工作方案提供依据。未知有效成份或有效部位：①依据预先确定目标。（试验室惯用）②以适当活性测试体系为指导。③提取、分离、动物模型筛选。④临床验证。提取

天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第2页中草药有效成份提取

提取是研究天然产物一个主要步骤，惯用方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。水蒸气蒸馏法：适合用于有挥发性能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水成份提取。比如挥发油类成份。升华法：适合用于含有升华性质成份提取。比如樟脑、咖啡因等溶剂提取法:选择适当溶剂将中草药中化学成份从药材中提取出来。

天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第3页1.概念：依据天然药品中各种化学成份溶解性能，选择对有效成份溶解度大而对其它成份溶解度小溶剂，用适当方法将所需化学成份尽可能完全从药材组织中溶解提出方法。溶剂提取过程是溶剂对药材组织细胞不停作往返扩散、渗透、溶解过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解化学成份浓度达平衡为止。一、溶剂提取法天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第4页2.溶剂提取法提取原理：依据化合物在极性相同溶剂中有很好溶解性即“相同者相溶”这一原理进行。极性从低到高次序依次是：石油醚<二硫化碳<苯<无水乙醚<三氯甲烷<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<乙腈<水<吡啶3.溶剂极性与介电常数ε相关，介电常数越大，极性越大天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第5页

化合物极性大小与分子结构直接相关，普通来说两种基本母核相同成份，其分子中官能团极性越大或极性基团数目越多，则整个分子极性就越大表现亲水性越强，分子非极性部分越大或碳链越长则极性越小，亲脂性越强。化合物极性天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第6页

天然产物极性大致可分为三类：极性（亲水性）、非极性（亲脂性）、中等极性（即亲水又亲脂）。

亲脂性成份：萜类、甾体、脂环、芳香族成份，可选取氯仿、乙醚、石油醚等非极性溶剂。

亲水性成份：糖苷、氨基酸等，可选取水、含水醇等极性溶剂。

酸性、碱性及两性化合物：依据存在状态（游离型或解离型）。可选取不一样PH值溶剂。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第7页

选择溶剂标准：选择适当溶剂是提取步骤关键。主要依据溶剂极性、被分离成份性质、共存其它成份（杂质）性质三个方面。

对于提取溶剂要求：①对所提取成份溶解度大，对杂质溶解度小，或反之；②溶剂不能与所提取成份发生化学反应，若反应应该可逆；③要经济易得，含有一定安全性；④沸点适中、便于回收和重复使用。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第8页⑴水亲水性成份。有时为了增加一些成份溶解度，也常采取酸水及碱水作为提取溶剂。如：多数游离生物碱是亲脂性化合物，不溶或难溶于水，但与酸结合成盐后，能够离子化，加强了极性，变为亲水性物质，所以通惯用酸水提取生物碱；对于有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成份，常采取碱水提取，可使成份易于溶出。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第9页用水作溶剂提取存在一些问题：①易酶解苷类成份，且易霉坏变质；②对于含果胶、黏液质类成份较多中草药，其水提取液常呈胶状，极难过滤；③含淀粉多中草药，沸水煎煮时，淀粉可被糊化，过滤困难，所以不宜磨成细粉水煎；④含皂苷成份较多中草药，水提液在减压浓缩时，常会产生大量泡沫，浓缩困难。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第10页⑵亲水性有机溶剂能与水混溶有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等。乙醇虽易燃，但毒性小，价格廉价，起源方便，有一定设备即可回收重复使用，且乙醇提取液不易发霉变质。所以乙醇是试验室和工业生产中应用范围最广一个溶剂。甲醇性质虽和乙醇相同，但因为有毒性，所以少用。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第11页⑶亲脂性有机溶剂与水不能互溶有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚等。这些溶剂选择性能强，不能或不轻易提出亲水性杂质，易提取亲脂性物质。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第12页

这类溶剂易挥发，多易燃（氯仿除外），普通有毒，价格较贵，设备要求也较高，操作需要有通风设备；透入植物组织能力较弱，往往需要长时间重复提取才能提取完全。药材中水分存在，会降低这类溶剂穿透力，极难浸出其有效成份，影响提取率，所以对原料干燥程度要求较高。所以，在大量提取或工业生产时，直接应用这类溶剂有一定不足。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第13页4.提取前预处理：通常粉碎成粗粉；种子类先脱脂；水溶性成份提取宜将药材切成小段、薄片或粗粉；苷类要预防酶水解；苷元及次生苷要保留酶活性等等。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第14页5.影响提取原因：（1）药材粉碎度药材粉碎得越细，中药粉末表面积越大，提取效率高，但粉碎过细，则表面吸附作用也增强，反而影响扩散速度，降低了提取效率，另首先，杂质提取量也增高。普通情况下，用有机溶剂提取时，以过20目筛为宜。用水提取时，则用粗粉或薄片。溶剂提取法关键是选择适当溶剂和提取方法，但在操作过程中，还受其它原因影响。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第15页（2）温度

普通来讲，热提取效率高，但杂质多，冷提杂质少，效率低。加热温度不宜超出100℃。在50～60℃条件下进行提取保持很好提取率，又不使过多杂质溶出。（3）时间和提取次数

药材中有效成份伴随提取时间延长而出量增大，直到药材细胞内外有效成份浓度到达平衡为止。普通情况下，用水加热煮时以每次1～2小时为宜，进行2～3次。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第16页6.提取方法

惯用提取法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法。

(1)浸渍法此法适合用于有效成份遇热易挥发和易破坏中草药提取。按溶剂温度分为热浸、温浸、冷浸等。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第17页操作：现将中草药粉或碎片装入适当容器中，然后加入适宜溶剂，浸渍药材以溶出其中有效成份。特点：简单易行，但提出率较低。最好采取二次、三次浸渍，以降低损失，提升提取率。假如溶剂为水话，需加入适当防腐剂。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第18页(2)渗漉法操作：将中草药粉末装在渗漉器中使药材浸渍24~48小时膨胀，然后不停添加新溶剂，使其自上而下渗过药粉，从渗漉筒下端出口流出、搜集浸出液。当溶剂渗进药粉溶出成份比重加大而向下移动时，上层溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好浓度差，使扩散能很好地进行，故浸出效率较高，当浸出液很浅时提取基本完全。但溶剂消耗量大、费时长。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第19页渗漉装置天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第20页(3)煎煮法操作：将中药粗粉加水加热（加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热轻易焦糊）煮沸，将中药成份提取出来。普通药材易煎2次。所用容器普通为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第21页特点：此法简便，能煎出大部分有效成份，但煎出液中杂质较多，且轻易发生霉变，一些不耐热挥发性成份易损失。所以含挥发性成份及有效成份遇热易破坏中药不宜用此法，对含有多糖类中药，煎煮后，药液比较粘稠，过滤比较困难。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第22页(4)回流提取法如用易挥发有机溶剂加热提取中药成份时，则需采取回流提取法以降低溶剂消耗，提升浸出效率。但受热易破坏成份不宜用此法，且溶剂消耗量仍大，操作亦麻烦。此法提取效率较冷浸法高，不过因为操作不足，大量生产中多采取连续提取法。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第23页（5）连续提取法：为了填补回流提取法中需要溶剂量大、操作较烦不足，可采取连续提取法。试验室惯用索氏提取器。此法需要溶剂量较少，提取成份也比较完全，但普通需数小时（提取液受热时间长）才能完成，所以对热不稳定易改变成份不宜用此法。尽管如此，在应用挥发性有机溶剂提取时，不论小型试验或大型生产均以连续提取法为好。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第24页索氏提取器天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第25页(6)超声提取技术

利用超声波空化作用，破坏植物药材细胞，使溶剂易于渗透细胞内，同时超声波强烈震动能传递巨大能量给浸提药材和溶剂，使他们做高速运动，加强了胞内物质释放、扩散和溶解，加速有效成份浸出，极大地提升提取效率。超声波在传递过程中形成许多小空穴，这些小空穴瞬间闭合，可形成几千个大气压压力，同时局部温度可到达千度以上，这种现象叫做空化天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第26页无需高温。适合用于热不稳定。常压提取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。提取效率高。适用性广，绝大多数中药材各类成份均可超声提取。提取工艺成本低，综合经济效益显著。特点操作将药材粉末置适宜容器内，加入定量溶剂，密闭后置于超声波提取器，选择适当超声频率提取一段时间。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第27页（一）水蒸气蒸馏法：是将含有挥发性成份药材与水共蒸馏，使挥发性成份随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成份浸提方法。当馏出液由浑浊变为澄清时，表示蒸馏已基本完成。该法适合用于含有挥发性、难容或不溶于水、与水不会发生反应、能随水蒸气蒸馏而不被破坏中草药成份提取。如，麻黄碱就能够用此法直接从麻黄中蒸馏出来，这个方法主要用于挥发油二、其它提取方法天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第28页天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第29页(二)升华法有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来固体化合物，该现象称之为升华。对于含有升华性质有效成份，可采取升华法提取。如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡碱。此法简单易行，但在实际提取时极少采取。因为升华所需温度很高，中草药轻易炭化，炭化后产生挥发性焦油状物，轻易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第30页天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第31页超临界流体：一物质处于临界温度（Tc）与临界压力（Pc）以上状态下，形成既非液体又非气体单一相态时，称为超临界流体。

特点：流体密度近似液体，粘度于气体相同，扩散力比液体大，介电常数随压力增大而增加，渗透性优于液体。比液体溶剂有更佳溶解力，有利于溶质萃取。（三）超临界流体萃取技术天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第32页二氧化碳优点：1）不残留有机溶剂、萃取速度快、收率高，安全不易燃烧及化学性质稳定。2）萃取温度较低，适合用于对热不稳定物质提取。3）萃取介质溶解特征轻易改变，一定温度下改变压力。4）能够加入夹带剂，改变介质极性。5）适于对极性较大和分子量较大物质萃取。6）萃取介质可循环利用，无毒，成本低。惯用作超临界流体物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第33页超临界萃取不足：1）对脂溶性成份溶解能力强，对水溶性成份溶解能力弱。2）设备造价高，设备折旧费百分比大。3）更换产品时清洗设备较困难。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第34页提取天然药品得到提取液是混合物，需要进行深入分离与精制。去其糟粕，取其精华。1.溶解度差异：如结晶法、沉淀法等2.分配比不一样：如萃取法3.吸附性差异：物理吸附、化学吸附及半化学吸附4.分子大小差异：透析法、凝胶滤过法、超滤法5.离解程度不一样：离子交换法或电泳分离依据：共存成份性质差异第二节分离精制和判定方法与技术天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第35页1.系统溶剂提取法：是研究天然药品成份初步提取分离方法。用极性从低到高溶剂依次提取。石油醚→油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类氯仿或醋酸乙酯→游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素苷元丙酮或乙醇、甲醇→苷类、生物碱盐、鞣质等水→氨基酸、糖类、无机盐等本法缺点：因为各成份之间助溶作用，同一类成份往往也会分散在邻近几个部位中。但系统溶剂法仍是研究成份不明天然药品最惯用方法。一、依据物质溶解度差异进行分离天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第36页2.结晶与重结晶法结晶和重结晶是利用固体混合物中各种成份在溶剂中溶解度差异，使所需成份以结晶状态析出，到达分离精制目标。结晶溶剂选择：（1）不与结晶物质发生化学反应；（2）对结晶物质溶解度随温度不一样有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；对可能存在杂质溶解度非常大或非常小；（3）沸点适中，不宜过高或过低。惯用溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等。还可用两种或两种以上混合溶剂天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第37页操作：在将被提取物晶体置于单口瓶中，加入较需要量稍少适宜溶剂，加热到微微沸腾一段时间后，若未完全溶解，可再添加溶剂，每次加溶剂后需再加热使溶液沸腾，直至被提取物晶体完全溶解（但应注意，在补加溶剂后，发觉未溶解固体不降低，应考虑是不溶性杂质，此时就不要再补加溶剂，以免溶剂过量）。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第38页温度不一样——溶解度差异结晶、重结晶待纯化物A+杂质B、C加MeOH热溶热滤残渣（C）滤液（A+B）冷置析晶母液（B）结晶（A）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第39页3.沉淀法：在溶液中加入一些试剂或溶剂，使部分物质沉淀析出，到达分离目标。

解离型/离子态游离型/分子态H+BH+BOH-H+A-HAOH-脂溶性水溶性（1）酸碱沉淀法

经过加入酸、碱以调整溶液PH值改变分子存在状态，从而改变溶解度而到达分离目标。

天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第40页A．酸/碱法（酸提取碱沉淀法）

——生物碱提取、纯化H+BH+BOH-醇提物浸膏（B）药渣酸水提取液稀酸水提取（BH+

）碱化沉淀（B）碱水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第41页药材（HA）药渣碱水提取液碱水提取（A-

）酸化沉淀（HA）酸水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）B．碱/酸法（碱提取酸沉淀法）

——黄酮、蒽醌等酚性成份提取、纯化H+A-HAOH-天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第42页（2）试剂沉淀法利用成份能与一些试剂产生沉淀，或利用一些成份在不一样溶剂中溶解度差异，经过加入特定试剂或溶剂使生成沉淀，到达分离目标。比如：酸性化合物与钙、钡、铅等生成水不溶性盐产生沉淀。生物碱与苦味酸、磷钼酸等生物碱沉淀剂形成水不溶性盐沉淀；雷氏铵盐与季铵碱生成生物碱雷氏铵盐沉淀；胆固醇与甾体皂苷生成沉淀；蛋白质与鞣质形成沉淀等天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第43页A.水/醇法—除去多糖、蛋白质、淀粉、无机盐等水溶性杂质。B.醇/水法—除去脂溶性油脂、树脂、叶绿素等水不溶性杂质。C.醇/乙醚（丙酮）法—因皂苷类在醇中溶解度大，而在乙醚中溶解度小沉淀析出。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第44页A．水/醇法——除去水提液中水溶性杂质中药水提取液加数倍量浓醇静置过夜母液（目标成份）沉淀（水溶性杂质）（如蛋白质、多糖、果胶、粘液质）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第45页B．醇/水法：除去醇提液中脂溶性杂质中药醇提取液加数倍水静置过夜母液（目标成份）沉淀（脂溶性杂质）（如油脂、叶绿素等）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第46页C．醇/醚法（醇/丙酮法）：纯化皂苷皂苷醇溶液加数倍量乙醚，静置母液（脂溶液杂质）沉淀（皂苷）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第47页二、依据物质在两相溶剂中分配比不一样进行分离

常见有简单液-液萃取法、逆流分溶法（CCD）、液滴逆流色谱（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、液液分配色谱（LC/LLC）、纸色谱（PC）等。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第48页1.液-液萃取与分配系数K值原理：利用混合物中各成份在两种互不相溶溶剂中分配系数不一样而到达分离目标。依据分配定律，化合物在一定温度和压力下，溶解在两个同时存在互不相溶溶剂里，到达平衡后，该化合物在两相中浓度比是一个常数，称为分配系数K值。

K=CU/CLCU表示溶质在上相溶剂中浓度；CL表示溶质在下相溶剂中浓度（一）两相溶剂萃取法提取液中加入一个与其互不相溶溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成份分配系数差异进行分离天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第49页

各成份在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率就越高。K=CU/CL

举例：A、B两种溶质在CHCl3/H2O中进行分配，如A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比为VCHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上溶质A将分配在上相溶剂（水）中，不到10%A分配到下相溶剂（氯仿）中。一样道理，溶质B分配将与A相反。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第50页

定义：分离因子可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数比值。如上例，则其分离因子β=KA/KB，即KA=10；KB=0.1；

β=KA/KB=10/0.1=100

普通，β≥100时，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；但100>β≥10时,则须萃取10-12次；β≤2时，要想实现基本分离，须作100次以上萃取才能够。β≈1时，则KA≈KB。意味着二者性质极其相近，用分配无法实现分离。2.分离难易与分离因子β天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第51页3.逆流连续萃取法：是一个连续两相溶剂萃取法。其装置可含有一根、数根或更多萃取管。利用两种互不相溶溶剂相对密度不一样，使相对密度小相液作为流动相，逆流连续穿过相对密度大作为固定相相液，借以交换溶质而到达分离目标。优点：操作简便，萃取较完全，防止乳化。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第52页4.逆流分溶法（CCD）此法相当于屡次萃取。在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不停地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不停地重新分配并到达分离目标。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第53页流动相液滴垂直上下，经过固定相液

5.液滴逆流色谱（DCCC）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第54页6.纸色谱法以滤纸为支持剂，滤纸上吸着水为固定相，用一定溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成份分配系数差异到达分离目标。纸色谱原理与液-液萃取基本相同。

操作技术点样：点样量普通为几毫克至几十毫克，点样量大则点样原点宜大些。展开：上行法或圆形法显色：先在日光或紫外灯下观察有没有颜色或荧光，再喷洒对应显色剂。计算比移值（Rf）：原点至色谱斑点中心距离/原点至溶剂前沿距离天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第55页7.液-液分配柱色谱固定相涂覆于硅胶等多孔载体上，装柱流动相经过色谱柱进行洗脱物质在两相溶剂中作逆流分布

——分配系数不一样，被洗脱速度不一样原理：天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第56页慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第57页载体：有硅胶、硅藻上、纤维素粉正相色谱：固定相：水、缓冲液流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇※适合分离水溶性或中等极性成份：生物碱类、苷类、糖、有机酸。用流动相洗脱时，极性小成份先被洗脱。反相色谱：固定相：石油醚、异三十烷、石蜡油流动相：水、甲醇※适合分离脂溶性化合物：高级脂肪酸、油脂、游离甾体。当用流动相洗脱时，极性大成份先被洗下来。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第58页加压液相柱色谱为了提升分液速度，缩短分离时间，在加压条件下进行分离，加压液相色谱用载体多为颗粒直径很小，机械强度与比表面积比普通色谱用硅胶大球形微粒，按所加压力不一样可分为：

快速色谱（FLC）2个气压，分离范围10mg-g

低压液相色谱(LPLC)<5个气压，分离范围10mg-1g

中压液相色谱(MPLC)5-20个气压，分离范围100mg-g高压液相色谱(HPLC)>20个气压，分析型:分离范围ug-10mg制备型:分离范围mg-g天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第59页天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第60页分馏法：利用各沸点不一样化合物，在分馏过程中产生高低不一样蒸气压，从而搜集到不一样沸点温度馏分到达分离目标。三、依据物质沸点不一样进行分离天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第61页四、依据物质吸附性差异进行分离

原理：利用混合物中各成份对吸附剂吸附能力不一样而到达分离，其中固-液吸附用得最多，分为物理吸附，化学吸附及半化学吸附。物理吸附：分子间力，无选择性，可逆。硅胶、氧化铝、活性炭化学吸附：化学键，选择性较强，常不可逆。硅胶——生物碱碱性氧化铝——黄酮、蒽醌等半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆聚酰胺天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第62页1.物理吸附基本规律——相同者易于吸附

吸附过程中三大要素：吸附剂、溶质、溶剂非极性吸附剂：活性炭对非极性成份吸附强溶剂极性

吸附剂对溶质吸附力

溶质易被极性弱溶剂洗脱极性吸附剂：硅胶、氧化铝对极性物质亲和力强溶剂极性

吸附剂对溶质吸附力

溶质易被极性强溶剂洗脱天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第63页惯用吸附剂氧化铝、硅胶、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、活性炭等。（1）硅胶：为一多孔性物质，可用通式SiO2·χH2O表示。它含有多孔性硅氧环，SiOSi交键结构，因为其骨架表面含有很多游离、键合和键合－活性状态硅醇基。它能够经过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量水分。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第64页

硅胶含水量与活性关系活性加入水量（%）

I0II5III15IV25V38活化：100-110oC30min天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第65页（2）

氧化铝：是一个吸附力很强亲水性吸附剂，有酸性、碱性和中性三种规格。其吸附活性也与含水量相关氧化铝含水量与活性比较活性加入水量（%）

Ⅰ0Ⅱ3Ⅲ6Ⅳ10Ⅴ15天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第66页活性炭吸附法结晶、重结晶中脱色、脱臭从大量稀水液中浓缩微量物质（3）活性炭简单吸附法用于物质浓缩与精制天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第67页（4）

吸附柱色谱用于物质分离在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用最多。

天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第68页吸附剂与样品量百分比：30～60：1

极性小，难以分离样品：100～200：1

色谱柱长度与内径百分比：15～20：1

吸附剂粒度：100目，难以分离样品可采取200～300目。粒度太细，谱带轻易扩散，可采取加压色谱。操作时需要注意问题天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第69页样品与吸附剂装柱吸附剂选取极性小溶剂装柱，样品一样以湿法装柱。假如样品在极性小溶剂中溶解度小，则改用极性大溶剂溶解后，再用不到装柱量1/20吸附剂拌匀，于60℃下加热挥散溶剂，研细后再小心铺在吸附剂柱上。洗脱用溶剂极性应逐步增加往往采取梯度洗脱，实践中多用混合溶剂，普通混合溶剂中强极性溶剂影响比较大。不可随意将极性差异很大两种溶剂混合使用。对于极性较大成份惯用氯仿-甲醇，按不一样百分比梯度洗脱，对比较轻易洗脱极性小成份，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第70页为防止发生化学吸附：酸性物质分离选取硅胶、碱性物质分离则选取氧化铝为好。碱性物质用硅胶分离时：在洗脱溶剂中加入碱性物质（氨、吡啶、二乙胺等）；酸性物质用氧化铝分离时：洗脱剂中加入醋酸等。经过TLC进行筛选溶剂系统：在TLC展开时使组分Rf值到达0.2-0.3溶剂系统，为柱色谱最正确洗脱溶剂系统。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第71页薄层层析是将作为固定相支持剂均匀地铺在支持板（普通是玻璃板）上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜溶剂展开，从而使样品各组分到达分离层析技术。假如支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；假如支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时主要依据是分配系数不一样，则称之为薄层分配层析；假如支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析薄层层析天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第72页薄层板制作支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。惯用薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉等)，调成糊状物所制成薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可直立展开，而软板只能近水平展开。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第73页层析方法点样距底边1-1.5cm处，用毛细管点样，直径不超出2-3mm展开展式方式与纸层析一样，有上行法、下行法等，但软板薄层只能近水平展开（与水平成10o-20o）。吸附薄层层析所用展开剂主要是低沸点有机溶剂，普通采取2-3种组分多元溶剂系统。展开剂选择是依据被分离物极性、溶剂极性以及支持剂特征三方面来考虑。显色：可先在日光下观察，标出众斑并确定位置，然后在紫外灯下观察和标识，必要时在选择显色剂显色观察。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第74页定性与定量分析薄层层析法用Rf值来表示被分离物质在薄层上位置，与已知标准物质Rf对照，可进行定性分析。定量分析时，可把斑点所在位置支持剂连同物质一起刮下，然后用适当溶液将其从支持剂上溶解下来，再测定其含量。用目测法比较样品斑点和对照品斑点颜色深度和面积大小，或测量斑点面积，能够进行半定量分析和程度检验，有条件时，可用薄层扫描仪进行定量分析。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第75页AB

ⅠCHCl3：MeOH(7:3)ⅡCHCl3：MeOH(3:7)吸附剂：硅胶天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第76页2.半化学吸附---聚酰胺色谱

聚酰胺吸附色谱属于氢键吸附。对于极性物质和非极性物质都适用，主要适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。聚酰胺性质1.高分子聚合物2.不溶于水和惯用甲醇、乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂3.对碱稳定4.对酸尤其是无机酸稳定性差5.可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第77页聚酰胺吸附原理:氢键-半化学吸附因为分子中含有酰胺羰基及游离胺基，在水溶液中能与含有酚羟基以及羰基化合物经过氢键结合而被吸附，从而与不含上述基团化合物分离。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第78页吸附规律：（含水溶剂中）①形成氢键基团数目越多，吸附能力越强②易形成份子内氢键者，吸附对应减弱③分子中芳香化程度高，吸附作用增强

天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第79页各种溶剂在聚酰胺柱上洗脱能力水甲醇乙醇氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液化合物在不一样溶剂中吸附力，随溶剂极性增强而增强水中最强———常以水装柱、样品以水溶解上样含水醇中次之醇中最弱———常以浓度渐高含水醇梯度洗脱

EtOH-H2O最惯用

弱强吸附规律：（含水溶剂中）天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第80页

操作：用水装柱,样品也尽可能做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提升醇浓度。各种溶剂在聚酰胺柱上洗脱能力为：水＜甲醇（乙醇）＜丙酮＜氢氧化钠水溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液聚酰胺色谱应用：醌类、黄酮类等酚性制备和分离。脱鞣处理生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物分离也有用途天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第81页五、依据物质分子大小差异进行分离

天然有机物分子大小不一样，表现出不一样分子量，故能够依据分子量大小进行分离。惯用方法有：

透析法:利用半透膜膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉胶)

凝胶滤过法：利用凝胶三维网状结构。

超滤法：利用分子大小不一样引发扩散速度差异。

超速离心法：利用溶质在超速离心引发作用下含有不一样沉降性或浮游性。

※以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类脱盐精制及分离工作。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第82页1.透析法：透析法是利用小分子及小离子在溶液中可经过半透膜而大分子及大离子不能经过性质，借以到达分离。如分离纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等成份时，即可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第83页2.凝胶滤过法（gelfiltration）原理：是利用分子筛分离物质方法。所用载体葡聚糖凝胶在水中不溶解，但遇水后膨胀成含有三维空间结构球形颗粒。因为凝胶网孔半径限制，大分子物质不能渗透凝胶颗粒内部，故只在颗粒间隙移动，并随溶剂一起先从柱底流出，小分子因能自由地渗透到凝胶内部，经过色谱柱时阻力增大，流速变慢，后流出。样品混合物中各个成份因分子大小各异，渗透凝胶颗粒内部程度不一样，按分子由大到小次序先后流出得以分离。天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第84页凝胶三维网状结构分子筛作用按分子量由大到小次序分离天然药物化学天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术专家讲座第85页凝胶种类与性质

惯用有葡聚糖凝胶（Sephadex-G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。(1)Sephadex-G

由平均分子量一定葡聚糖与交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成，生成凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂数量及反应条件。加入交联剂数量越多，网孔越紧密，孔径越小，交联度越高，吸水膨胀也越小，反之，交联度越低，网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号按交联度大小分类，并以吸水